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Promega/FuGENE® 6 Transfection Reagent/1kit/E2692
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Promega/FuGENE® 6 Transfection Reagent/1kit/E2692
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Promega
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蛋白质免疫印迹(Western Blot )可以:(1)从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;(2)定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。 查看更多>
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当然可以鉴别多种蛋白,属于半定量分析方法。跑胶后转膜,然后加一抗二抗检测第一种蛋白,曝光过后,洗几遍加另一种一抗和二抗,以此类推就可以
因为线粒体蛋白是细胞亚显微结构,必须用电镜观察,可以用,免疫电镜技术,和电镜放射自显影技术.推荐第二种:1放射性同位素标记的生物大分子前体参入,2,常规方法制片,3,在样品上敷上一层溴化银乳胶(要求更严格),在暗室里曝光数天(时间更长),经显影定影后,4移至电镜下观察,银颗粒所在位置即放射同位素标记的位置.
作为一个基础实验初学者,第一次接触动物实验但因为需要发SCI才能毕业,现因做兔子的有关肺的实验,需要测定肺组织TNF-α、IL-1β、MIP-2的ELISA试剂盒,TLR2和4的WB的抗体,HMBG1的中和剂和HMBG1免疫组化检测的抗体。请各位推荐一下什么公司的产品比较精确,当然价格不要太贵。有什么好的建议也请多指教
如题,有没有人用过SignalBoostTM免疫信号增强试剂盒,到底好不好用,效果真有说明书上说的那么好吗
simplex tests是一种试剂瓶,分为广口瓶和细口瓶,和试剂盒是不一样的。
一、广口瓶。
广口瓶是用于盛放固体试剂的玻璃容器,有透明和棕色两种,棕色瓶用于盛放需避光保存的试剂(例如硝酸银等大部分硝酸盐)。广口瓶一般用于存放试剂,瓶口内部磨砂,用于与瓶塞配合使用。
取用试剂时,瓶塞要倒放在桌上,用后将塞塞紧,必要时密封。由于瓶口内侧磨砂,一般跟玻璃磨砂塞配套,因而玻璃塞的广口瓶不能盛放强碱性试剂。如果盛放碱性试剂,要改用橡皮塞,因为强碱与玻璃中的二氧化硅反应,生成硅酸盐,使口与塞粘连。
二、细口瓶。
一种用于存放液体试剂的玻璃容器,细口方便液体倾倒,并且能够避免试剂挥发,因此口比较小。有透明和棕色两种,棕色瓶用于盛放需避光保存的试剂。
取用试剂时,瓶塞要倒放在桌上,用后将塞塞紧,必要时密封。由于瓶口内侧磨砂,一般跟玻璃磨砂塞配套,因而不能盛放强碱性试剂。如果盛放碱性试剂,要改用橡皮塞。
可能可以通过下面几个方法实现(仅供参考):
1. 使用预染 Marker,不过分子量不是特别准;
2. 所使用的 Marker 条带与待测蛋白质带有相同的抗原表位,比如都带有 His 融合标签;
3. 可以使用普通的 Marker 转膜使用 丽春红 等染色,然后在膜上标记出 Marker 各条带的位置。
嗯,磷酸化蛋白的抗体一定要选好,最好不要买santa的,可以买upstate的,就是millipore的,或者abcam的。
第一,血清成分复杂,最好用密理博的Montage Albumin Deplete Kit去除血清里50%的白蛋白
第二,磷酸化蛋白提取蛋白的时候,最好加入原钒酸钠,和磷酸酶抑制剂,防止蛋白脱磷酸化。
第三,不要用牛奶做封闭剂,用BSA。因为牛奶中含有磷酸化酪蛋白,防止非特异带。
第四,如果条带杂带多,而且,条带弱,可以选择millipore的signal boost,增加条带特异性,而且,增强条带的亮度。
买了南京凯基的膜蛋白和浆蛋白提取试剂盒,浆蛋白有条带,可是膜蛋白跑了很久没跑出过条带。。。
之前是担心所需组织量不够(要求是200-300mg,我的组织只有20mg左右)才跑不出来,后来换用大鼠心脏测试,组织量绝对够。。。而且在跑western之前进行了说明书上的蛋白浓缩步骤,可是在加loADIngbuffer之后,蛋白沉淀怎么都溶解不掉~说明书也注明了如果有沉淀可以取上清继续上样,可是每次上样感觉样品往上浮,只有部分样品往孔里沉,而且跑出来什么都没有,连内参都没有。用的是β-actin的内参。。
western之前浓缩步骤如下:
1、取所得提取物,每100ul膜蛋白加入约300ul的溶解buffer和约100ul三氯乙酸(TCA)试剂,混匀后置冰上20-30min后,13000rpm,离心15min,尽可能去除上清。
2、沉淀加入1ml丙酮,室温静置10min后,13000rpm离心15min。
3、弃上清,沉淀真空旋干或置冰上干燥10min(敞开离心管盖),按适当体积比加入loadingbuffer(使用前没100ulloadingbuffer加入2-5ulβ-巯基乙醇)溶解,彻底分散(枪头反复吹吸或剧烈涡旋),煮沸5min。【注:加入loadingbuffer后如有部分难容物,可取上清继续上样。】
我现在在用WB检测APP蛋白,但是总是不成功,不知道是否是蛋白提取有问题,因为APP蛋白是膜蛋白,我用的是总蛋白提取试剂盒,希望有经验的同志指点一下。谢谢!
天根RNA试剂盒DP419提取的蛋白可以做WB吗:分三层后,上层是RNA,那个中间层的蛋白怎么提出来纯化一下做WB?请高手解答,非常感谢!
据我所知不是所用的单克隆抗体都适合用WB来检测的。有些抗体经过SDS-PAGE后蛋白会有些变性,这部分抗原决定簇会被破坏。然后你用一抗去识别是识别不出来的,也就是印染后会没有条带的。
当然做都是可以做,需要带上阴性和阳性的对照组,以区别出是抗体制备的问题还是抗原决定簇被破坏的问题。
这个膜的两面是不一样的。一面粗糙,一面光滑吧。如果这个算正反面的话,那么就是有正反面的。但是对于WB来说在转膜前是没有正反面之分的。你用粗糙的面贴着胶转膜和光滑的面贴着胶转膜,蛋白都能转到膜上去的。不会因为你膜贴反了而蛋白转膜不成功啥的。
转膜后就要区分与胶接触的一面与另一面了。话说楼主好奇的话可以跑蛋白的试试看哈。比如目的蛋白的胶用光滑面贴着胶,内参蛋白用粗糙面贴着胶一起转膜试试转膜结果看看呢。
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