
Description
Details
Maleimide modified fluorescent dye with Absorption 653 nm / Emission 672 nm, suitable for protein labeling, microarray experiments, FisH microscopy, and gel electrophoresis. Spectral similar to Cy5™ and Alexa Fluor® 647, commonly used with RadiantDy™ 547. The increased water solubility of RadiantDy™ fluorescent dyes allows a high label to protein ratio without precipitation during the conjugation reaction.
ebiomall.com






>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
第一,血清成分复杂,最好用密理博的Montage Albumin Deplete Kit去除血清里50%的白蛋白
第二,磷酸化蛋白提取蛋白的时候,最好加入原钒酸钠,和磷酸酶抑制剂,防止蛋白脱磷酸化。
第三,不要用牛奶做封闭剂,用BSA。因为牛奶中含有磷酸化酪蛋白,防止非特异带。
第四,如果条带杂带多,而且,条带弱,可以选择millipore的signal boost,增加条带特异性,而且,增强条带的亮度。
转膜后就要区分与胶接触的一面与另一面了。话说楼主好奇的话可以跑蛋白的试试看哈。比如目的蛋白的胶用光滑面贴着胶,内参蛋白用粗糙面贴着胶一起转膜试试转膜结果看看呢。
之前是担心所需组织量不够(要求是200-300mg,我的组织只有20mg左右)才跑不出来,后来换用大鼠心脏测试,组织量绝对够。。。而且在跑western之前进行了说明书上的蛋白浓缩步骤,可是在加loADIngbuffer之后,蛋白沉淀怎么都溶解不掉~说明书也注明了如果有沉淀可以取上清继续上样,可是每次上样感觉样品往上浮,只有部分样品往孔里沉,而且跑出来什么都没有,连内参都没有。用的是β-actin的内参。。
western之前浓缩步骤如下:
1、取所得提取物,每100ul膜蛋白加入约300ul的溶解buffer和约100ul三氯乙酸(TCA)试剂,混匀后置冰上20-30min后,13000rpm,离心15min,尽可能去除上清。
2、沉淀加入1ml丙酮,室温静置10min后,13000rpm离心15min。
3、弃上清,沉淀真空旋干或置冰上干燥10min(敞开离心管盖),按适当体积比加入loadingbuffer(使用前没100ulloadingbuffer加入2-5ulβ-巯基乙醇)溶解,彻底分散(枪头反复吹吸或剧烈涡旋),煮沸5min。【注:加入loadingbuffer后如有部分难容物,可取上清继续上样。】
1、如果是提取的总蛋白,然后做WB,用β-actin或者GAPDH做内参肯定是没有问题的,这是公认的东西。
2、如果用膜蛋白提取试剂盒提取蛋白,再用β-actin作为内参似乎不妥,因为理论上来讲β-actin在膜上是不表达的。WB能做出β-actin来是因为膜蛋白提取时把胞质蛋白也提出来了。然而,如果我们试验目的是用药物处理细胞,比较处理前后某种膜蛋白的表达情况,此时用膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白后再用β-actin做内参似乎就不妥了,因为你根本不知道药物处理前后混杂了多少的胞质蛋白进来。如果没有胞质蛋白混进去的话,β-actin就是检测不到的。

