【外泌体系列六】研究外泌体的三家国外公司
大片段DNA的测序:通过鸟枪法(ShotGunSequencing)测序鸟枪法测序的操作方法1.用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA,并用Agarose凝胶电泳进行回收。2.对回收的大片段DNA用物理方法(如超声波等)进行切断处理，然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。3.进行Agarose电泳，切胶回收1kbp~2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3"端加上一个A碱基。4.把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。5.对阳性克隆（含1kbp~2kbpInsert）进行DNA测序。6.对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。DNA测序量应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算(针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率)，对每个反应的有效测序长度定义为600Bases。如：对100kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算：6倍测序量＝100,000Bases×6/600Bases＝1000个反应8倍测序量＝100,000Bases×8/600Bases＝1333个反应结果编辑按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序，然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段(Contig)。补缺工作结果编辑工作结束后，会发现在数个DNA大片段(Contig)间的序列没有测定，此时应该通过primerwalking来测序，进行整体DNA序列的补缺工作。
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发布于 ： 2018-12-26
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