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Echelon/Whole-Cell MEP Pathway-Selective Antibacterial Screening Assay Service/SAMPLE/T-2000
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Echelon/Whole-Cell MEP Pathway-Selective Antibacterial Screening Assay Service/SAMPLE/T-2000
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The Whole-Cell Methylerythritol Phosphate (MEP) Pathway-Selective Antibacterial Screening Assay, described in [1], utilizes a genetically engineered strain of Salmonella typhimurium (CT31-7d) that can utilize either the MEP or the mevalonate (MVA)pathways in order to produce isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP), the two essential precursors for all isoprenoids. In the absence of arabinose and MVA, the MEP pathway is utilized for growth. When supplemented with arabinose and MVA, the engineered MVA pathway is activated. Compounds inhibiting MEP pathway growth with no effect on MVA pathway growth are selective for the MEP pathway. Validated using known MEP pathway inhibitors and other antibacterials, the screening platform is more sensitive to MEP pathway inhibitors than wild-type S. typhimurium. Antibacterials targeting other pathways demonstrate similar minimum inhibitory concentrations (MICs) for both MEP and MVA pathway growth.

The Whole-Cell MEP Pathway-Selective Antibacterial Screening Assay is performed in a 96 well plate and consists of two stages:1. Primary Antibacterial Screen: This screen uses our engineered cell line under growth conditions with only the MEP pathway active to identify initial antibacterial “hits”. Compounds are added in a 96-well plate and screened in duplicate. This screen tests a single concentration (usually 100 µg/mL) or a user determined amount against each pathway. We are able to screen up to 80 compounds per plate in duplicate.2. Secondary MEP Pathway-Selectivity Screen: Antibacterial “hits” are subjected to dose response analysis evaluating MEP growth in one plate and MVA in a second to determine MICs for both growth conditions. Using CT31-7d and different growth conditions allow us to determine if the antibacterial hit displays specificity toward the MEP pathway. Dose-response experiments are performed on 4 compounds per plate in duplicate for the secondary screen. Fosmidomycin, a known MEP pathway inhibitor, is included in both screens as a positive control. The concentration used (33 μM) is insufficient to kill wild-type bacteria, but is effective against CT31-7d due to heightened MEP pathway sensitivity.


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Isoprenoid, MEP Pathway

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EchelonBiosciences成立于1997年10月3日,总部坐落于在美国犹他州。从1997到2004,EBI主要用于政府的补助金以及产品的销售收入来资助其研究工作。2005年初,EBI的依特钠Zentaris购买(NAS:AEZS)的MEP抗感染,PI3激酶小分子程序,目录业务,与科学专业。2007年末,前沿科学公司(FSI)在洛根,犹他州购买了EBI,专业从事卟啉和硼化学。自公司成立以来以来,EBI保留了开发研究试剂脂质新的检测方法。不断开拓**,从而推动药物研究的新发型。


EchelonBiosciences是美国杰出免疫学产品供应商,专业提供各种抗体、分析检测试剂盒、抑制剂等产品,尤其擅长以细胞信号、脂类代谢和标记物研究为主的相关产品。为研究治疗诸如癌症、糖尿病、炎症、感染和心脑血管疾病专家提供**有效工具。


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一笔230万美元的国防部赠款将帮助神经科学家为急诊室和战场开发新的治疗方法。这项研究将集中于开发新的疗法,以帮助保护大脑和其他在创伤、心脏病发作或中风后处于危险中的器官。

罗彻斯特大学医学中心的神经学家MarcHalterman,M.D.,Ph.D该研究的首席研究员说:“虽然我们在中风或心脏骤停后恢复血液流动的能力方面取得了重大进展,但医学界并没有药物来防止这些事件发生后的继发性损害。“这项资助将进一步推进我们对一类既具有抗炎作用又具有细胞保护作用的药物的研究,我们相信这类药物将适用于军事和紧急情况。”该项目是与盐湖城的一个合成抗生素化学家团队合作开发的,该团队由MarkNelson,Ph.D领导,他将担任EchelonBiosciences的副研究员。





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人体内多种组织和器官内含有肌酸激酶,其分布不均.主要分布在骨骼肌的肌纤维内.因此,运动容易使血清肌酸激酶活性升高,其原因是因为运动时缺氧,代谢产物堆积,供能相对不足等原因引起肌细胞膜通透性升高,或肌细胞膜受到损伤,促使酶从细胞内释放增加,酶进入血液循环,其中尤以肌肉牵拉的机械性损伤或产生血肿等原因较为重要.不同的运动负荷,包括长距离自行车,滑雪及马拉松跑对机械性影响较大,可以导致血清肌酸激酶的活性升高,特别是大强度的马拉松跑后4小时后开始升高,8小时达高峰.跳跃,短跑等短时间激烈运动是冲击性运动,也引起血清肌酸激酶活性升高.运动员在比赛后,肌酸激酶可上升至734 IU/L左右(正常值200IU/L以下),与急性心肌梗死病人数值相近,但运动员血清肌酸激酶来自骨骼肌.为了避免运动后血清肌酸激酶的升高,检查血清肌酸激酶时应避免激烈的运动,以免临床误诊.以下是CPK增加的原因,也是临床诊断的依据:1.各种类型肌营养不良均可发生CPK活力升高,其中假肥大型肌营养不良酶的活力约可达正常的10--50倍.2.肌肉创伤可使CPK活力升高.3.剧烈运动,手术,肌肉注射也可引起此酶活性升高.4.脑血管意外,脑膜炎,甲状腺机能低下等也可使CPK活力升高.5.急性病毒性或风湿性心肌炎时CPK活性可达正常时的5倍.6.急性心肌梗时,早期阳性检测率高,特异性强,酶活力上升程度与疾病严重程度相一致.wanghanlin9852010-2-3 22:31:51您好:您肺部疾患现在没有完全确诊,肌酸激酶增高根据您的病情考虑心脏受累,建议查下心脏彩超有无器质性改变,根据病情在进行治疗.
磷酸化酶与激酶的区别123
落颜颜13722018-02-09
激酶(kinase):是能够在ATP和任何一种底物之间起催化作用,转移磷酸基团的一类酶。ATP有三个磷酸基团,其中两个是通过一个高能磷酸键结合,激酶的作用是催化这个高能磷酸键的水解,并利用释放出来的能量,将一个磷酸基团转移到底物分子上。值得一提的是,激酶的活性需要镁离子的存在,因为参与激酶反应需要镁离子和ATP形成Mg—ATP复合物。 织梦内容管理系统ATP+底物————底物-P+ADP kinase 一般是什么底物,就称什么激酶。例如,己糖激酶........ dedecms.com磷酸化酶(phosphorylase):是一种催化磷酸解的酶。比如说,A和B基团通过酯键相连,磷酸酶则催化酯键水解,并使一个基团带上磷酸基团。内容来自dedecms A-O-B+Pi —— AOH+ B-Pi phosphorylase 比较典型的磷酸化酶就是:糖原磷酸化酶 dedecms.com磷酸酯酶(phosphatase):属于一种水解酶类,它是通过催化磷酸酯键水解的酶。织梦好,好织梦 本文来源于子午学术论坛(http://www.ziwu.org/bbs ),原文地址:http://www.ziwu.org/html/shiyanjishu/shengwuhuaxuejishu/200812/09-111123.html

新药研发中激酶类靶点酶学检测方法的建立和优化

成都先导药物黄药师


一个早期药物发现的项目往往是从高通量筛选(HTS)拉开序幕,我们得到这么一批种子,它们称为hits。当然这些hits在invitroassay中对靶蛋白有抑制作用,但它们并不完美,可能还需要一轮一轮的打磨,从而筛选得到具有更高抑制效率,更高生物利用度,更安全的先导化合物,这个过程称为SAR(structureactivityrelationship)。先导化合物的优化往往从potency开始,同时还要优化solubility,safety,absorption,metabolicstABIlity。这本书从potency的优化着手,讲解了invitroassay的建立;另外小分子化合物可能以不同的方式结合靶蛋白,意味着每种小分子可能有着不同的结合动力学参数,为了达到最佳的体内药效,检测与分析小分子的作用模式也十分重要。


1.激酶酶学检测方法的建立

激酶的酶学assay并不难,但为了得到清楚可靠的数据在建立assay时需要进行一系列的优化。其中需要优化的要素包括:ATP,底物,激酶的浓度,反应buffer的成分,反应时间。本文用AGC激酶家族的ROCK2作为一个例子,分析激酶的酶学assay优化步骤。


第一步,确定assay底物是否合适,确定激酶浓度与assay信号间的线性。

Assay优化的目的是为了使assay既能够给出尽量高的信号又确保激酶活性与信号间的线性,因此找到一个能够被激酶高效磷酸化的底物是assay建立的第一步。同时,需要确定一个合适的激酶浓度进行assay优化。当激酶的浓度较低,在一定反应时间内得到的信号值较低,信噪比也较低。在过高激酶浓度的反应体系之中,随着反应进行大量底物都被充分转化,导致激酶活性失去与信号值间的线性关系(Figure1.1)。所以我们应该选择信号值较高并与激酶活性呈线性关系这样的激酶浓度条件。


Figure1.1激酶活性与assay信号之间的线性关系

对ROCK2酶学assay的优化中,首先检测了ROCK2的7种底物在不同ROCK2浓度下的磷酸化效率。实验中发现S6-derivedpeptide作为底物能够得到最高信号,线性区域在0.5-7nMROCK2浓度。因此可以选定S6-derivedpeptide作为底物,0.5nMROCK2作为优化的激酶浓度。


Figure1.2ROCK2不同底物随激酶浓度变化的磷酸化信号


第二步,优化反应buffer降低assaywall

反应buffer优化的目的是为了使反应体系达到在尽量低的激酶浓度下产生尽量高的信号。之所以要使用尽量低的激酶浓度,一方面是降低成本的考虑,另一方面激酶浓度本身也限制的IC50的检测下限。一个激酶的酶学assay所能检测的IC50值不可能低于反应体系中激酶浓度的一半(Figure1.3)。比如assay中ROCK2的浓度是1nM,那么我们只能检测到IC50最低为0.5nM的抑制剂。即使真实IC50值为0.1nM,而我们通过assay检测到的IC50值(IC50obs)依然是0.5nM。这一现象被称为“assaywall”。因为如果反应体系中小分子化合物的摩尔量已经小于激酶量的一半了,那么每两个激酶已经分不到一个化合物,不能够使半数的激酶活性得到抑制。因此随着SAR的推进,IC50逐渐变小,我们应该注意IC50是否已经接近assaywall。

Figure1.3随着激酶浓度升高不同化合物IC50obs不同程度偏离真实IC50

当然我们也可以通过优化反应buffer,进一步降低体系中激酶的浓度,从而降低assaywall。由于大多激酶依赖Mg2+或Mn2+离子作为中间反应的磷酸根受体,所以buffer的优化应该包括:Mg2+,Mn2+,Na+,Ca2+等离子浓度,去垢剂的浓度,pH值。图1.4表明不同的Mg2+与Mn2+浓度组合对assay的影响。在10mMMg2+,没有Mn2+的条件下,assay具有最好的信号。另外NaCl,CaCl2,正钒酸钠降低assay信号,而Tween20,TritonX-100或NP-40对assay信号没有显著影响。用不同的buffer系统覆盖pH5.5-8.5区域,发现最佳的pH值为7.5。

Figure1.4ROCK2反应buffer离子、去垢剂浓度、pH的优化

不同激酶的MgCl2/MnCl2偏好差异较大。ROCK2喜欢10nMMgCl2和无MnCl2的buffer;PknG激酶喜欢有Mn2+无Mg2+的环境;而PDGFRβ则Mg2+、Mn2+通吃(Figure1.5)。此外,不同激酶对CaCl2,去垢剂和磷酸酶抑制剂的耐受都有差异。


Figure1.5不同激酶对MgCl2/MnCl2的偏好差异


第三步,米氏常数与ATP浓度的选择

由于大多数的激酶抑制剂是ATP竞争抑制剂,因此ATP的浓度决定了该assay是否能够有效评价小分子抑制剂的作用。如果在所有激酶assay中使用相同的ATP浓度可能会使抑制剂选择性筛选更加方便,但是将导致我们不能够准确比较一个抑制剂对不同激酶的抑制作用。因为根据Cheng-Prusoff方程,IC50与ATP浓度呈线性关系。其斜率就是由抑制常数Ki和米氏常数Km决定的。Ki反映抑制剂与激酶的亲和力,Km反映ATP与激酶的亲和力。由于一个抑制剂与不同的激酶结合有不同的亲和力,不同的激酶与ATP的亲和力也不一样。因此利用Cheng-Prusoff方程可知,不同激酶斜率不同的情况下,统一的ATP浓度中IC50并不能客观反映抑制剂与激酶的亲和力。图1.6中,10μMATP与20μMATP下,抑制剂对不同激酶的IC50并不一致,无法进行比较。所以在assay中我们一般也不会采用胞内ATP的生理浓度。除去以上原因之外,还因为我们对不同细胞种类,细胞亚结构,不同病理情况下的ATP浓度缺乏研究。

而根据图1.7的Cheng-Prusoff方程,当ATP浓度等于Km值时,IC50等于两倍Ki,因此能够直接反应抑制剂与激酶间的亲和力。Km的定义是一半最高反应速率时的ATP浓度,这样对于不同的激酶反应ATP浓度是不一致的。所以对于ROCK2酶学assay的ATP浓度,先计算Km为25μM,因此应该选择25μMATP浓度。


Figure1.6IC50随ATP浓度而变化,对于不同激酶其斜率并不一致


Figure1.7当ATP浓度等于Km值时,IC50等于两倍Ki


第四步,反应时间与激酶浓度与信号线性的考察。

在优化好buffer成分和ATP浓度后,下一步就需要进一步优化激酶浓度与反应时间,保证信号在线性范围内测得的IC50(IC50obs)反映真实的IC50。越长的反应时间,越高的激酶浓度,将导致更多的底物被转化,随着底物转化的比例增高,IC50obs/IC50的值逐渐增大(Figure1.8)。如图1.9,我们可以选择不同的ROCK2激酶浓度和反应时间组合。如果需要更短的反应时间,可以选择10nMROCK2浓度和60min反应时间;如果需要更低的ROCK2浓度得到更低的assaywall,则可以选择2.5nMROCK2浓度和240min反应时间。

Figure1.8IC50obs/IC50随着底物转换比例升高而增大



Figure1.9不同ROCK2浓度和不同反应时间的优化


第五步,检测referenceinhibitorIC50确认assay结果的可靠性

最后就是需要采用优化好的反应条件验证referenceinhibitor的IC50。一方面,测得的IC50需要与相关报道在3倍误差内,另一方面,反映IC50曲线斜率的Hillcoefficient要在0.5-1.8之间。如果Hillcoefficient偏离1较多,可能是反应体系中有其他激酶的污染,或者是该激酶的其他剪切突变体、二聚体、不同的磷酸化状态的存在。

进行完这一系列的优化,这个assay就可以用于药物筛选和SAR了。后面将继续介绍药物分子与激酶结合模式的检测,激酶靶标相关的ADME检测。


极光激酶(aurorakinases)是负责调控细胞有丝分裂的一类重要的丝氨酸/苏氨酸激酶。在细胞有丝分裂中,极光激酶参与了诸如中心体成熟分离、纺锤体组装和维持、染色体分离以及胞质分裂等多个事件......
为什么有的书籍(葛均波院士参与编写的指南)强烈要求溶栓前必须肝素化,不管是特异性的溶栓药还是非特异性的,包括尿激酶,意即,先静推肝素,然后滴尿激酶,之后继续每小时维持使用肝素。请高人回答,谢谢。
肌酸激酶(CK)主要存在于骨骼肌,脑和心肌组织中.增高可见于心肌损伤坏死,脑血管疾病,急性脑外伤,酒精中毒,全身性惊厥,癫痫发作时血清CK的水平增高;甲状腺功能减退出现黏液性水肿和脑梗死时CK水平亦可增高.手术后,心导管,冠状动脉造影,运动试验,反复肌注,剧烈运动,肌酸激酶可一过性增高生活护理:建议去医院做个比较仔细的检查,以便确定是哪方面的原因好对症治疗磷酸肌酸激酶(CPK),主要存在于骨骼肌和心肌,在脑组织中也存在,是参与体内的能量代谢的一种酶.在临床上主要用于诊断心肌梗塞.心肌梗塞患者发病后2-4小时,血液中此酶活动即开始升高.比血清中谷草转酸酶和乳酸脱氢酶的活力变化都出现得早. 临床意义: (1)心肌梗塞后,CPK较谷草转氨酶和乳酸脱氢酶特异性高,但持续时间短,2-4天恢复正常. (2)病毒性心肌炎,CPK也可升高,对诊断及预后有参考价值. (3)进行性肌营养不良,多发性肌炎以及肌肉损伤时CPK也可升高. (4)严重的心绞痛,心包炎,房颤,脑血管意外,脑膜炎以及心脏手术等,CPK可见升高. 正常值:无机磷法:0-200U/dL 比色法:M(男):0.55-7.5U/dL F(女):1.45-4.0U/dL 肌酸激酶高达1000 可能是双腿不能行走有痛疼感引起的,建议你做详细的检查以明确是什么原因导致的,及早进行相应的治疗.
相关疾病:血栓形成请教各位大神,请教一下:尿激酶能否被血液透析所清除,目前查了一些文献,找不到具体的。长期导管存在血栓形成和纤维套鞘,有时候常规尿激酶封管、尿激酶溶栓效果可能不佳,在透析中出现血流不足,可否边透析边滴注......

2013dialysisofdrugs.pdf(170.37k)
葡萄糖激酶是调节人体血液中葡萄糖水平的重要酶,主要作用是监控血中的葡萄糖水平。临床上,由于葡萄糖激酶过度激活或者失活,导致血液中葡萄糖水平过低或过高,继而引发2型糖尿病和高血糖症病变。因此,以葡萄糖激酶为靶标的抗糖尿病研发引起了各界的广泛关注。对于葡萄糖激酶临床突变研究和以葡萄糖激酶为靶标的药物开发来说,靶标自身功能机制的阐述是亟需解决的重要问题之一。由于葡萄糖激酶催化葡萄糖磷酸化时需要大规模的构象变化,现有的实验方法还不能有效地检测这些变化,同时葡萄糖激酶-ATP-葡萄糖三元复合物晶体结构很难测定。在葡萄糖激酶—构机制研究的基础上(PNAS 2006, 103, 13368-13373),蒋华良研究员带领研究生张健等综合利用计算生物学和分子生物学方法,对葡萄糖催化的机制进行了深入系统的研究。采用分子模拟和分子动力学方法在构建了葡萄糖激酶-ATP-葡萄糖三元复合物的三维结构,获得了精确的葡萄糖激酶的催化反应环境,发现了与葡萄糖激酶催化活性密切相关的一系列重要残基,其中Lys169残基在底物ATP和葡萄糖的结合中发挥决定性作用,首次合理地解释了临床上常见的K169N缺陷型葡萄糖激酶突变体的分子机理。与沈旭研究员课题组合作,用分子生物学实验和酶动力学学分析方法验证了理论计算结果(这部分工作主要由黎陈静完成)。该研究为进一步开展临床上缺陷型葡萄糖激酶突变体的治疗以及设计抗糖尿病药物提供了重要信息,也是上海药物所药物发现与设计中心用理论计算与实验相结合的方法研究生物学问题的又一成功案例
蛋白激酶(protein kinases)又称蛋白质磷酸化酶(protein phosphakinase)。一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。
根据磷酸化的底物不同,可将蛋白激酶分为组蛋白蛋白激酶、酪蛋白蛋白激酶等,但由于蛋白激酶可磷酸化底物的多样化,这种分法很不确切,已经被根据底物磷酸化氨基酸的分类方法所取代,有些如酪蛋白蛋白激酶,只是由于习惯而一直被沿用下来。根据有无调节物将蛋白激酶分为信使依赖的蛋白激酶和非信使依赖的蛋白激酶,有些信使依赖的蛋白激酶的首字母缩略词已为人们所接受,如cAMP依赖的蛋白激酶PKA、钙和磷脂依赖的蛋白激酶PKC以及钙依赖钙调素不依赖的蛋白激酶CDPK等,它们彼此间存在结构和功能上的相关关系。

也有人认为:蛋白激酶在信号转导中主要作用有两个方面:其一是通过磷酸化调节蛋白质的活性,磷酸化和去磷酸化是绝大多数信号通路组分可逆激活的共同机制,有些蛋白质在磷酸化后具有活性,有些则在去磷酸化后具有活性;其二是通过蛋白质的逐级磷酸化,使信号逐级放大,引起细胞反应.

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豆子豆子11102017-07-26
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