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RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程,该过程通过双链RNA(dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解,或者通过小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性(下面讨论),通过短反义核酸(siRNA和shRNA序列)锁定细胞mRNA,从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集,导致其水平的下降,最终实现抑制作用。[放大]图1. siRNA和shRNA结构。(A)siRNAs是短的RNA双链,在3‘端有两个碱基的游离。(B)shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。(C)shRNA构建用于插入表达载体。源自[1, 2]。背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年,Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而,直到1998年,Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果,他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA(siRNA或shRNA)、Dicer酶,Argonaute蛋白家族的蛋白质(具体来说是Ago-2)、Drosha、RISC、TRBP和PACT。
表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA(siRNA或shRNA)、Dicer酶,Argonaute蛋白家族的蛋白质(具体来说是Ago-2)、Drosha、RISC、TRBP和PACT。术语描述siRNA小干扰(siRNA),有在3’端有两个碱基的游离,可激活RNA干扰,通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。shRNA短发夹RNA(shRNA),包含一个环结构,可加工成siRNA,也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.Drosha是一种核糖核酸酶III的酶,可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。Dicer核糖核酸酶III酶,能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA,而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用RISC最小RNA诱导沉默复合物(RISC)包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。TRBPDicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要PACT蛋白R(PKR)-激活蛋白(PACT)。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关.Argonautefamilyofproteins和单链的RNA(siRNA)共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA,包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA,然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链(引导链)RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。表一:RNAi机制的主要组成元件。siRNA vs. shRNA作用机制两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA(siRNA)和基于载体的短发夹RNA(shRNA)。虽然siRNA和shRNA(图1)都可用于蛋白沉默,但它们的作用机制有所不同(图2)。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中(参见转运机制获取更多细节)。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的,但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物,双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合,RISC由Argonaute-2(Ago-2)、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白(TRBP)组成。然后RNA的两条链分开,其中一条链从复合物上分离。5"端双链稳定性最低的那条链被选择出来,稳定的并入沉默复合物中。[放大]图2. RNAi介导的基因沉默机制。在细胞核表达后,shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中,在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上,它们与siRNA的加工方式(以短的双链形态导入细胞,然后被Dicer识别)相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后,它们识别mRNA占有互补序列,导致其降解。源自[3]。shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成,形成发夹结构,茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起(图1b和1c)。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制,shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体,shRNA被导入靶细胞的细胞核内,在某些情况下,载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同,shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前,这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切,去除发卡结构,产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。一旦被整合到RISC后,shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分,siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA,从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点,siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物,而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA,然后由Dicer酶加工,形成正反馈循环,增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。该过程图2中有阐述。人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而,Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出,RISC不是作用于未折叠的RNA。他们提出了一个模型,在该模型中,RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触,5"末端碱基配对比3"末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。
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