Grade
Shipping Condition
Hazardous
CAS#
Storage
Packaging
Retest
UN
Class
PG
Restrictions
Biomatik—供应生物试剂、免疫、基因、多肽/蛋白、抗体 Biomatik公司成立于2002年,致力于为全球科研工作者供应高质量的分子生物学、免疫学、药物研发等领域产品及服务。供应的产品囊括生物试剂,重组蛋白,ELISA试剂盒,定制基因、多肽及抗体等产品。此外,我们还提供完善的生物制品定制服务,包括基因、多肽/蛋白及抗体等。为研究人员提供zui优的产品和服务是我们赖以成功的保证,因此我们确保我们的产品与服务具有百分百的满意度保证。 Biomatik公司主要产品: 一、生物试剂系列产品:该系列产品含有360多款实验室常用的生化、酶类及PCR试剂,多款产品有不同的纯化级别(Biotechnology、 High Purity、 Ultra Pure、 Certifiable 、ACS 、USP等),这些产品备有存货,可尽快发货到实验室。 二、免疫检测产品系列:(ELISA /CLIA试剂盒):该产品系列包括7200多款ELISA /CLIA试剂盒,5300多款重组蛋白产品。 三、定制化合成基因:Biomatik在化学合成基因上有着丰富的经验,特别在长复杂基因合成上,可保证在zui短的时间内完成100%精确度的基因合成。 四、定制化多肽合成:Biomatik是高质量多肽合成领域中的佼佼者,所提供的合成产品纯度可从粗提至99%以上纯度(依据客户需要),合成量可从毫克到千克级。 五、定制化重组蛋白产品:Biomatik提供E.coli源重组蛋白产品,优质低价。未得到所要求蛋白全额退款。 六、定制抗体产品:Biomatik在定制抗体上执行着严酷的质量标准,所提供的单/多克隆产品定制服务可在两月内完成。
Biomatik公司于2002年在加拿大成立,是生物试剂一站式购物中心,提供7000多种ELISA试剂盒,5300多种重组蛋白,350多种生物试剂。 特色产品包括定制基因和多肽、以及PCR产品和酶。特色生化试剂包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、琼脂糖、白蛋白、核糖核酸酶A(RNase A0)\蛋白酶 A 和溶菌酶、半乳糖苷等。﹙网址:http://www.biomatik.com ) 日前,毕特博生物公司已成功取得Biomatik的授权和代理,Biomatik的各大产品均可在我司查询订购。 加拿大Biomatik成立于2002年,公司创建伊始就以为全世界的生命科学和药物研发工作者提供高质量的科研用品和服务为奋斗目标。 产品涵盖生化试剂、重组蛋白、ELISA试剂盒、基因定制和多肽合成及蛋白及抗体的定制生产等。 公司之所以能成功,因为我们始终把您的科研需要摆在第一位,为您独一无二的研究项目提供完美的产品和服务。 我们的长远目标是成为您科研道路上中可靠的合作伙伴。 Biomatik为您提供工业领先的创新产品和高效的客户服务。 公司在为您提供高质量的产品,满足您科研需要的同时,也为您节省研究经费,努力创造双赢的局面。 这为我们在业内带来持续不断的竞争力,成长和品牌认可,也是我们所推崇的高质量产品服务带来的回报。
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
下图为ELISA原理图,夹心法即Sandwich ELISA,竞争法就是Competitive ELISA
向左转|向右转
1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃ 过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。
2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时,洗涤。
4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分钟。
5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
间接法
1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜;
2.次日洗涤3次;
3.加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤;
4.(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml;
5.37℃孵育35-60分钟,洗涤;
6.’最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
(2)封闭:将已包被的板用洗涤液洗涤2次,每孔加入120 μL封闭液,封闭一段时间,取出,甩干备用。
(3)竞争反应:在制备好的板中每孔加入50 μL系列浓度的标准品溶液和50 μL稀释好的酶标抗体溶液,孵育一段时间。
(4)洗板:用洗涤液洗涤5次。
(5)显色反应:每孔加入显色溶液100 μL,孵育一段时间。
(6)终止:每孔各加入终止液,在酶标仪上测定各孔的吸光值。
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:(1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型:
1.双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2) 加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3) 加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4) 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测。
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。
2.双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。
3.间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:
1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2)加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4)加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质,例如来自人血浆或人体组织的抗原,如不将其中的Ig去除,试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封闭(blocking)固相上的空余间隙。另外,在检测过程中标本须先行稀释(1:40~1:200),以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
4.竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的,可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
5.竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
6.捕获包被法测抗体
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒(HAV)抗体的检测模式。
类风湿因子(RF)同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体,导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐,用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
7.ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白,分子量60000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物,分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物,标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反应大得多,两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合,因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原)。在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性糖蛋白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点,在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂,增加了操作步骤,在临床检验中ABS-ELISA应用不多。
我现在用商品化的试剂盒进行夹心法ELISA测定某抗体的浓度,盒子给定了4个标准品,标准品抗体浓度为70000~1000单位,测定步骤中要求对样品进行1:1000稀释后测定。
但是有的样本按照1:1000稀释后,最终OD值大于70000浓度的标准品的OD值,然后使用ELISACALC软件进行四参数拟合,超过了标准曲线的范围,就算不出来这个样品的浓度,但是如果在1000-70000之间的OD值就可以算出相应浓度。请教大神们,接下来我是否可以对样品进行1:2000,1:4000浓度稀释,算出结果后再×2、×4,算作此样品的浓度呢?还是直接给一个>70000的定性结果?或者可以有能算出来的其他软件?
Ps试剂盒中提及Dilutionlinearity(稀释线性?)为141%,这个是什么意思呢?
多谢!!
后采用豆粉浸提12000g离心取上清的方式,发现10的5、6、7、8次方稀释度所测OD值随着稀释度的升高而增大,比如一个样品的OD值5次方为0.2558次方为0.349;
刚接触相关知识,试验任务较重,心中疑问较大,恳请各位高手及时指正,诚谢!
(一)双抗体夹心法
(二)间接法
(三)竞争法
(四)双位点一步法
(五)捕获法测IgM抗体
(六)应用亲和素和生物素的ELISA