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ELISA有些什么方法？各有啥优缺点？

(1)单抗包被-抗原-酶标二抗-底物显色。本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。(2)单抗包被-抗原-二抗-酶标二抗-底物显色。(改良双抗体夹心法)本法首先是将特异性抗体a包被于固相载体，经洗涤加入含有欲测抗原之待检样品。经孵育洗涤后再加一次未标记的特异性抗体b，而这次加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。经孵育洗涤后，再加酶标记抗b抗体，再经孵育洗涤后加底物显色进行测定。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。

ELISA双抗体夹心法原理
ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。
生物帮有相关介绍。编码RNA http://doc.bio1000.com/show-3399.html

双抗体夹心法：
(1) 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
(2) 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
(5) 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
(6) 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

说实在 我没听说过三步法，不知道你在说什么建议楼主查询文献吧

本人用一重组蛋白（该蛋白存在于人体的血清中）制备了该蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，并且单多克隆抗体都用竞争法证实了可以识别血清中该蛋白的天然形式。
目前，我用该蛋白的鼠源性单抗来包被ELISA板子，5%BSA37度封闭二小时后，洗涤四次后将板子分三个组加入抗原：其中一个组中加入的是我重组的蛋白，另一个组为用其它方法证实含该蛋白的人体内血清，最后一个组加入PBS。37度一小时后洗涤四次后每孔加入我制备的兔源性多抗。37度一小时洗涤六次后我再加入酶标记的抗兔的抗体37度40分钟后洗涤六次后TMB显色。
问题就在我显色后所有的孔都是阳性，其中以抗原为我的重组蛋白组与PBS组OD值最高，两组都可以达到1.8以上，而加入的抗原为人体血清组低，为0.6-1.0不等。
后面我优化条件，封闭液用过5%的脱脂奶粉，2%的BSA，包被的单抗浓度摸了梯度，加入的多抗也摸了梯度，酶标的抗体也摸了梯度。结果都没有改变，连趋势每次都是一样以重组蛋白组与PBS组OD最高。
今天我还试着把抗原换成其它蛋白也做出了强阳性？
请教各位高手，我的ELISA该如何往下面做了啊，是不是我的抗体本身有问题呢？
对了，我包被用的单抗是用GE公司的预装柱纯化的，很纯，在考染中是看不到一条杂带的。

两者其实叫同已 酶联免疫(eia) 翻译结:enzyme linked immunosorbent assay (eia) 缩写另种形式ELIS

（1）包被：用包被液将包被抗原稀释到合适浓度，每孔100 μL加入板孔中，包被过夜。
（2）封闭：将已包被的板用洗涤液洗涤2次，每孔加入120 μL封闭液，封闭一段时间，取出，甩干备用。
（3）竞争反应：在制备好的板中每孔加入50 μL系列浓度的标准品溶液和50 μL稀释好的酶标抗体溶液，孵育一段时间。
（4）洗板：用洗涤液洗涤5次。
（5）显色反应：每孔加入显色溶液100 μL，孵育一段时间。
（6）终止：每孔各加入终止液，在酶标仪上测定各孔的吸光值。

双抗夹心法ELISA标准曲线的问题
大家好,我在做双抗夹心法的elisa实验,已经花了20来天了，然而标准曲线的线性一直做不好，而且不稳定。下面我把具体的实验过程说下，希望大家能给我提个建议，谢谢！
首先我从以下数据中确定了标准品的起始稀释浓度:4.64,46.4,464,4640IU/ml对应的OD为0.55,1.178,1.086,1.168.因此我取46.4IU/ml(300ng/ml)作为标品的起始稀释浓度。然后作了关于单抗，多抗，二抗的合适稀释度的实验，我的数据如下：
123456789
空白0.2290.1920.2120.1540.1390.1730.2360.1770.257
46.4iu/ml1.2421.5271.2691.9641.6281.9592.0051.8802.163
9.28iu/ml0.9680.9501.0131.1360.8731.2461.6971.5861.769
阴性0.1920.1760.2500.1310.1610.1540.1990.2190.244
选取了7号组合单抗，多抗，二抗分别为1ug/ml,1ug/ml,0.5ug/ml。
标品按照以下梯度稀释：46.423.211.65.82.91.450.725iu/ml.以下是我近来做的三组数据,都是相对空白的相对值：

123
46.4iu/ml0.6130.5860.851
23.20.5240.6490.765
11.60.3820.510.663
5.80.3160.3850.567
2.90.2880.3190.37
1.450.2890.1340.303
0.7250.1210.1460.113
空白0.0820.0870.101
阴性0.0820.1050.101
似乎梯度都不明显。我现在疑惑的是我的标品浓度的设置有问题还是之前抗体的浓度选择不合适，请大家多指点，万分感谢！！！

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.
2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.
3) 加酶标抗体,保温反应.固相
免疫
复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.
4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2).
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心.
2.2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法.
竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合.标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应.如抗原为高纯度的,可直接包被固相.如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原.洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应.竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法.另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应.抗HBe的检测一般采用此法.
2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式.其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合.标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅.小分子激素,药物等ELISA测定多用此法.

夹心法夹心法常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为:将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果间接法间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为：将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原。加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结。洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。竞争法竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。洗去检体与带有酵素之抗原，加入酵素受质使酵素呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酵素的抗原越少，显色也就越浅。当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。

1、包被物和二抗的浓度需要在试试
2、封闭液肯定不好
3、显色时用封口膜盖好