
![]() ![]() | CatalogNo.: K-1000s Description: Echelon'sPI3-KinaseActivityELISA:Picoisacompetitive(96-well)ELISAassaykitthatmeasuresClassIPhosphoinositide3-kinases(PI3-K)activitydirectlythroughitsreactionproduct,PtdIns(3,4,5)P3(PIP3).ThisassaycanbeusedforinvitrodeterminationofPI3-Kactivityincancertissuesandcelllinesorcompoundscreeningfordrugdiscovery Assaysensitivity:Thisassaycanmeasureaslowas0.22pmolPIP3anddetectactivityfromaslittleas31ng/mLPI3-Kenzyme AssayIncubationtime:2.5hr SampleType:Purifiedand/orImmunoprecipitated(IP)PI3-KEnzyme(seeIPprotocolattheendoftheK-1000sTDS) | ||
ProductBackground:PI3-KreactionsarerunwiththeClassIPI3-KphysiologicalsubstratePI(4,5)P2(PIP2).Theenzymereactions,PIP3standards,andcontrolsarethenmixedandincubatedwithPIP3bindingproteinthatishighlyspecificandsensitivetoPIP3.ThismixtureisthentransferredtoaPIP3-coatedmicroplateforcompetitivebinding.Afterwards,aperoxidase-linkedsecondarydetectorandcolorimetricdetectionisusedtodetecttheamountofPIP3producedbyPI3-KthroughcomparingtheenzymereactionswithaPIP3standardcurve. FeaturedinPublications:1.A.E.Awad,V.Kandalam,S.Chakrabarti,X.Wang,J.M.Penninger,S.T.Davidge,G.Y.OuditandZ.Kassiri.(2010)"TumornecrosisfactorinducesmatrixmetalloproteinasesincardiomyocytesandcardiofibroblastsdifferentiallyviasuperoxideproductioninaPI3K?-dependentmanner"AmJPhysiolCellPhysiol298(3),C679-C6922.B.Venkatesan,S.D.Prabhu,K.Venkatachalam,S.Mummidi,A.J.Valente,R.A.Clark,P.DelafontaineandB.Chandrasekar.(2010)"WNT1-inducIBLesignalingpathwayprotein-1activatesdiversecellsurvivalpathwaysandblocksdoxorubicin-inducedcardiomyocytedeath"CellSignal22(5),809-20 3.J.J.Wallin,J.Guan,K.A.etal.(2012)"ActivePI3KPathwayCausesanInvasivePhenotypeWhichCanBeReversedorPromotedbyBlockingthePathwayatDivergentNodes"PLoSOne7(5),e36402 4.C.M.Furtado,M.C.Marcondes,R.S.Carvalho,M.Sola-PennaandP.Zancan.(2015)"Phosphatidylinositol-3-kinaseasaputativetargetforanticanceractionofclotrimazole"TheInternationalJournalofBiochemistry&CellBiology62,132-141 5.Poopal,A.C.,L.M.Schroeder,etal.(2016).IncreasedexpressionofthePI3Kcatalyticsubunitp110?underlieselevatedS6phosphorylationandproteinsynthesisinanindividualwithautismfromamultiplexfamily.7:1-12.doi:10.1186/s13229-015-0066-4 RelatedProducts: ClassIPI3KActivityAssays:Echelonhasmultipleformatsavailable.PleaseseethePI3-KAssayComparisonChart formoreinformation. ClassIIIPI3KActivityAssay(K-3000) LipidMassELISA's:PIP3MassELISA(K-2500s)andPI(4,5)P2MassELISA(K-4500) HumanPI3KEnzymes:alpha(p110α/p85α),beta(p110β/p85α),PI3KαE545K–ActiveMutant(p110α/p85α) MousePI3KEnzyme:PI3K(p110α/p85α) PI3KInhibitors NoticetoPurchaser:EchelonBiosciencesproductsaresoldforresearchanddevelopmentpurposesonlyandarenottobeincorporatedintoproductsforresalewithoutwrittenpermissionfromEchelonBiosciences.Thiskitandallnon-rADIoactive,competitiveassaysfordeterminingphosphoinositide-3-kinase(PI3-K)activityarecoveredbyEchelonBiosciencesInc.U.S.Patent7,067,269.Thepurchaseofthisproductincludesalimited,non-transferableimmunityfromsuitundertheforegoingpatentclaimsforusingonlythisamountofproductforthepurchaser'sowninternalresearch. ProductKeywords:PI3-Kinase,PI3K,Phosphatidylinositol3-kinases,PI3-kinases,PI3Ks,K-1000 BulkDiscounts: |
美国埃施朗(Echelon)公司在快速发展低碳经济和节约能源的大潮中,以美国埃施朗公司发明的LonWorks控制网络技术为基础的能源管理服务方案被越来越广泛的使用。在世界上有约9000万个内置埃施朗公司的智能网络芯片的终端设备被LonWorks控制网络连接在一起,由智能能源管理控制服务器通过Internet远程监视,控制,诊断和管理,如路灯、电表、执行器、传感器等等。其应用领域涉及楼宇、工厂、交通系统、家庭、公共设施,智能电网,绿色城市等。该能源管理服务方案包括150项专利,已有450多家OEM(原始设备制造商)厂商和90家特许集成商在为该方案提供产品和服务。通过Internet,无论是在办公楼里电梯门的开启和关闭,或者厂房间能源使用数据的采集,埃施朗公司的产品和服务使您在一个网络环境中管理设备。今天,LonWorks控制网络平台已成为全球控制网络技术的公认标准。我们在家庭、列车、半导体制造设备、智能楼宇、加油站、火车制动系统领域的网络系统解决方案,已经被许多世界标准组织采纳作为各自行业的标准,这包括:ISO/IEC对控制网络和楼宇管理规范的国际标准ISO/IEC14908-1,-2,-3和-4、中国控制联网标准GB/Z20177.1,.2,.3和.4、中国商业楼宇和住宅建设的国家标准GB/T20299.4-2006、AAR(美国铁路协会)、ANSI/CEA709.1,.2,.3和ANSI/CEA-852(美国国家标准协会),ASHRAE(美国暖通空调工程师协会),IEEE(电子电气工程师协会),IFSF(美国加油站标准论坛)和SEMI(半导体设备与材料协会)等。埃施朗公司在美国、英国、中国、日本、德国、法国、韩国和荷兰等地设立了办事处,在美洲、亚洲、欧洲各地都有商业伙伴,并为用户提供90多种产品。Echelon公司在NASDAQ股票交易所的交易代码是ELON。埃施朗公司中国代表处于一九九五年底成立,并于2001年初重新组建成埃施朗公司大中华区北京办事处至今,并设立多家代理更好地为广大中国用户提供产品和服务。其间,我们相继成立LonSupport大中华区技术支持中心、大中华区上海联络处、大中华区广州联络处。已经有超过百家中国厂商加入了LonWorks控制网络的OEM行列,从事开发新产品,承接公用事业、工业自动化、楼宇、小区智能化和运输等行业的项目。埃施朗公司将为中国的绿色,低碳,节能,环保的发展进入世界先进水平继续不懈地努力。
EchelonBiosciences成立于1997年10月3日,总部坐落于在美国犹他州。从1997到2004,EBI主要用于政府的补助金以及产品的销售收入来资助其研究工作。2005年初,EBI的依特钠Zentaris购买(NAS:AEZS)的MEP抗感染,PI3激酶小分子程序,目录业务,与科学专业。2007年末,前沿科学公司(FSI)在洛根,犹他州购买了EBI,专业从事卟啉和硼化学。自公司成立以来以来,EBI保留了开发研究试剂脂质新的检测方法。不断开拓**,从而推动药物研究的新发型。
EchelonBiosciences是美国杰出免疫学产品供应商,专业提供各种抗体、分析检测试剂盒、抑制剂等产品,尤其擅长以细胞信号、脂类代谢和标记物研究为主的相关产品。为研究治疗诸如癌症、糖尿病、炎症、感染和心脑血管疾病专家提供**有效工具。
EchelonBiosciences为生命科学社区提供的产品包括:
抗体 分析检测试剂盒
抑制剂 细胞信号产品
脂类代谢 标记物
一笔230万美元的国防部赠款将帮助神经科学家为急诊室和战场开发新的治疗方法。这项研究将集中于开发新的疗法,以帮助保护大脑和其他在创伤、心脏病发作或中风后处于危险中的器官。 罗彻斯特大学医学中心的神经学家MarcHalterman,M.D.,Ph.D该研究的首席研究员说:“虽然我们在中风或心脏骤停后恢复血液流动的能力方面取得了重大进展,但医学界并没有药物来防止这些事件发生后的继发性损害。“这项资助将进一步推进我们对一类既具有抗炎作用又具有细胞保护作用的药物的研究,我们相信这类药物将适用于军事和紧急情况。”该项目是与盐湖城的一个合成抗生素化学家团队合作开发的,该团队由MarkNelson,Ph.D领导,他将担任EchelonBiosciences的副研究员。
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请大家帮帮忙,第一步加完抗原后必须封闭吗
我现在用商品化的试剂盒进行夹心法ELISA测定某抗体的浓度,盒子给定了4个标准品,标准品抗体浓度为70000~1000单位,测定步骤中要求对样品进行1:1000稀释后测定。
但是有的样本按照1:1000稀释后,最终OD值大于70000浓度的标准品的OD值,然后使用ELISACALC软件进行四参数拟合,超过了标准曲线的范围,就算不出来这个样品的浓度,但是如果在1000-70000之间的OD值就可以算出相应浓度。请教大神们,接下来我是否可以对样品进行1:2000,1:4000浓度稀释,算出结果后再×2、×4,算作此样品的浓度呢?还是直接给一个>70000的定性结果?或者可以有能算出来的其他软件?
Ps试剂盒中提及Dilutionlinearity(稀释线性?)为141%,这个是什么意思呢?
多谢!!
下图为ELISA原理图,夹心法即Sandwich ELISA,竞争法就是Competitive ELISA
向左转|向右转
1、重复性不好;
2、收自身抗体、嗜异性抗体等干扰,易出现假阳性;
3、不论仪器和手工操作,干扰因素较多。影响最大的是温度和时间。1、直接法(direct ELISA)将抗原直接固定在固相载体上,参加酶符号的一级抗体,即可测定抗原总量,此一级抗体的特异性非常重要。优势:操作手续简略,因无须运用二抗可防止交互反响。缺陷:实验中的一抗都得用酶符号,但不是每种抗体都适合做符号,费用相对进步。2.间接法(indirect ELISA)此测定办法与直接法相似,不一样在于一级抗体没有酶符号,改用酶符号的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。优势:二抗能够加强信号,并且有多种挑选能做不一样的测定剖析。不加酶符号的一级抗体则能保存它最多的免疫反响性。缺陷:交互反响发作的机率较高。3.双抗体夹心法(sandwich ELISA)被检测的抗原包被在两个抗体之间,其间一个抗体将抗原固定于固相载体上,即捕捉抗体。另一个则是检测抗体,此抗体可用酶符号后直接测定抗原的量;或不符号,再透过酶符号的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体有必要当心选择,才可防止交互反响或竞争一样的抗原联系部位。优势:高活络、高专一性,抗原无须事前纯化。缺陷:抗原必定得具有两个以上的抗体联系部位。4.竞争法(competitive ELISA)样本里的抗原(自在抗原)和纯化并固定在固相载体上的抗原(固定抗原)一同竞争一样的抗体,当样品里的自在抗原越多,就能够联系越多的抗体,而固定抗原就只能联系到较少的抗体,反之亦然。经清洁过程,洗去自在抗原和抗体的复合物,只留下固定抗原和抗体的复合物,拿来与只要固定抗原的对照组成果相比拟,依据呈色区别就可计算出样品里的抗原含量。优势:可适用比拟不纯的样本,并且数据再现性很高。缺陷:全体的敏感性和专一性都较差。本数据来源于百度地图,最终结果以百度地图最新数据为准。
(2)封闭:将已包被的板用洗涤液洗涤2次,每孔加入120 μL封闭液,封闭一段时间,取出,甩干备用。
(3)竞争反应:在制备好的板中每孔加入50 μL系列浓度的标准品溶液和50 μL稀释好的酶标抗体溶液,孵育一段时间。
(4)洗板:用洗涤液洗涤5次。
(5)显色反应:每孔加入显色溶液100 μL,孵育一段时间。
(6)终止:每孔各加入终止液,在酶标仪上测定各孔的吸光值。
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:
(1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原
或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情
况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要
有以下几种类型:2.2.1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2) 加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
3) 加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合
的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4) 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。
在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、
AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合
物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动
物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相
载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标
抗体一起保温反应,作一步检测。
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标
抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应
后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的
吸光值相同(参见1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现
象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重
时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常
增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用
高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可
用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗
体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含
有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用
F(ab")或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗体
夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2)。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小
分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。2.2.2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应
的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需
稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采
用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。2.2.3 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗
体)以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法(见图2-3)。操作步骤如下:
1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2)加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗
体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗涤过程
中被洗去。
3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗
体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,
固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4)加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包
被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结
果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发
生反应的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能与受过
E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物
质,例如来自人血浆或人体组织的抗原,如不将其中的Ig去除,试验中也发生假阳性反
应。另外如抗原中含有无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的
特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体
上,有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质
(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封闭(blocking)固相上的空余间隙。另外,在检
测过程中标本须先行稀释(1:40~1:200),以避免过高的阴性本底影响结果的判断。2.2.4 竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特
异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体
量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯
度的,可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被
法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗涤除去抗原中的
杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式,可将标本
和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本
与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的
抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法
进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相
抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。
小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。2.2.6 捕获包被法测抗体IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断(early diagnosis)中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或
IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的
IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人
IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的
干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相,以捕
获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入
抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作
用,呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
(HAV)抗体的检测模式见图2-7。
类风湿因子(RF)同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体,导致假阳性反应。因此中和
IgG的间接法近来颇受青睐,用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。2.2.7 ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白,分子
量60000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物,分子量
244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分
子形成生物素标记产物,标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,
其亲和力较抗原抗体反应大得多,两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生
物素分子结合,因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲
和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系
统中的酶标抗体(抗原)。在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶
标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性
糖蛋白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的
链霉亲和素则无此缺点,在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通
ELISA多用了两种试剂,增加了操作步骤,在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

