| Kitsize | 12x8 |
| Method | ELISA |
| Incubationtime | 18h,1h,15min |
| Standardrange | 3-180pg/mL |
| Specimen/Volumes | 500µLSerum |
| Substrate/isotope | TMB450nm |
| RegulatoryStatus: | EU:CE |
TheLC-MS/MSisourreference
ThequantificationofthephysiologicallyactiveVitaminDmetabolite1,25-dihydroxyVitaminDisanecessarydiagnostictoolforseveralpathologicalconditionssuchas:
- Kidneydiseases
- Kidneytransplantation
- Sarcoidosis
- Rickets
- Osteomalacia
Thequalityofthemeasuringmethod,whichourassayfulfillsahundredpercent,thereforeisindispensable.
Thelevelsof1,25-dihydroxyVitaminDinplasmaorserumis100to1000-foldlessthanthatof25-hydroxyVitaminD.Duetoitslowconcentrationsandthepresenceofmanysimilarmetabolites,theexactmeasurementof1,25-dihydroxyvitaminDstillrequirestodoanextractionandseparationstepwithorganicsolventsofthesampleprioranymeasurementsystem.Thisextractionwithorganicsolventsstilltodayisthegoldstandardextractionmethod.
"Thesuccessiveabandonmentofsampleextraction,chromatography,[…]inimmunoassayshasundoubtedlycontributedtotheinconsistenciesreportedbyFarrelletal,[…]."(GrahamCarter,DEQASorganizer,CarterGD.ClinChem.2012;58(3):486-8.)
Theextractionsuppressesthepotentialinterferencefromsamplematrix,heterophilicantibodiesandabnormalconcentrationsofVitaminDbindingproteins.AndtheadditionalseparationonsolidphasecartridgesfurthersuppressestheinterferencefromotherVitaminDmetabolitessuchas25-hydroxyVitaminD,24,25-dihydroxyVitaminD,3-epi-25-hydroxyVitaminDand25,26-dihydroxyVitaminD.
ThisleadstogoodcorrelationofourELISAwiththegoldstandardtechnologyLC-MS/MS.
FurThermoretheELISAwasalsocorrelatedtothestillwidelyusedrADIoimmunoassayfromDiasorin.AlsoheretheELISAshowedagoodfit.
KeyfeaturesofourELISAare:
- GoodcorrelationwithLC-MS/MS
- VerylowLimitofDetection(1.7pg/mL)
- Limitednumberofincubationsteps
- DEQASsamplesaccuratelymeasured
- 108%cross-reactivityagainst1,25(OH)2VitaminD2
- GoldStandardextractionprotocolensuringnointerference
Generalinformation
1,25(OH)2VitaminDistheactiveformofVitaminDwithregardtotheknownfunctionswhereas25OHVitaminDandVitaminDitselfcanbeexcludedasbeingphysiologicallyfunctional.1,25(OH)2VitaminDstimulatestheintestinalabsorptionofbothcalciumandphosphorus.Italsostimulatesboneresorptionandmineralizationtherebypreventingthedevelopmentofricketsandosteomalacia.1,25(OH)2VitaminDisalsoactiveinothertissuesresponsibleforCalciumtransport(placenta,kidney,mammarygland,...)andendocrineglandssuchasparathyroidglands.1,25(OH)2VitaminDisrapidlymetabolizedanditshalflifeinplasmaisapproximately12h.Itsisfurthermetabolizedtoeithercalcitroicacid,essentiallywithoutanyBIOLOGicalactivity,orvia24-hydroxylationto1,24,25-trihydroxyvitaminD.Thiscompoundhaslessbiologicalactivitythanitsparentandthismetabolicrouteisconsideredasaminorpathway.Thelevelsof1,25(OH)2VitaminDinplasmaorserumis100-to1000-foldlessthanthatof25OHVitaminD.Duetoitslowconcentrationsandthepresenceofmanysimilarmetabolites,themeasurementof1,25(OH)2VitaminDrequiresextractionandseparationbychromatography.
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1. 直接法测定抗原 2．间接法测定抗体 3．双抗体夹心法测定抗原4. 竞争法测定抗原 厚百生物专业提供各类生化实验试剂、仪器、耗材，提供技术服务，满足您的实验室常规采购需求。厚百，让您更省心！
(1) 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
(2) 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
(5) 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
(6) 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
表面抗体是双抗原夹心法
E抗体和核心抗体是竞争抑制法或间接法
1. 包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二：用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30～60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
