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Encapsula/Immunosome®-Dodecanyl (Non-PEGylated)/2-ml/IMS-2053-2-ml
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Description
Numeroustechniqueshavebeendevelopedtoprepareimmunoliposomesbasedonthenucleophilicreactivityoffreeaminegroupsofproteinsorpeptides.OneofthemostpopularandcommonlyusedmethodsistocovalentlycouplefreecarboxylicgroupstoprimaryaminesthroughactivationofthecarboxylgroupswithEDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide).EDC,whichisaso-calledzero-lengthcrosslinkingagent,reactswiththecarboxyltoformanaminereactiveintermediate(O-acylisourea).TheproducedO-acylisoureacanbeeasilydisplacedbynucleophilicattackfromtheprimaryaminogroupsinthereactionmixture.However,thisintermediateisunstableandhydrolyzedinaqueoussolutions.Inordertopreventtheintermediatehydrolysis,sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)isaddedtoEDCtoproduceasignificantlymorestableandmoresolubleactiveintermediate(NHSester).
Consequently,theimmunoliposomesarepreparedbyatwo-stepcouplingprocedure:first,activatingthefreecarboxylgroupofthelinkerlipidincorporatedintheliposomeswithEDCandsulfo-NHS,andthencovalentlyconjugatingtheantibodiestothelipidsthroughdisplacementofsulfo-NHSgroupsbyantibodyamines,asdepictedbelow.EDC/sulfo-NHScouplingreactionsarehighlyselectiveandhighlyefficient,andtheBIOLOGicalactivityoftheproteinorpeptideispreserved.
Immunosome®-Donecanylisanon-PEGylatedproduct.Forotheraminereactive(PEGylatedandnon-PEGyalatedproducts)andalsoImmunosome®productssuitableforothertypesconjugationmethodsseehere.
FormulationInformation
Immunosome®-Dodecanyl(Non-PEGylated)
| LipidComposition | Concentration(mg/ml) | Concentration(mM) | MolarRatioPercentage |
|---|---|---|---|
| Total | 14.82mg/ml | 22.45mM | 100 |
| L-alpha-Phosphatidylcholine | 12 | 15.5 | 69 |
| Cholesterol | 2.6 | 6.73 | 30 |
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(dodecanyl) | 0.22 | 0.22 | 1 |
| BuffersandLiposomeSize | Specification |
|---|---|
| Buffer | PhosphateBufferedSaline |
| pH | 6* |
| LiposomeSize | 100nm |
| *InordertohaveahighlyefficientactivationreactionwithEDCandSulfo-NHS,pHofPBSbufferwasadjustedto6. | |
ConjugationProtocol
MaterialsandEquipment
Inordertoconjugatetheamineonyourantibody, proteinorpeptidetoImmunosome®-Dodecanyl(Non-PEGylated)liposomesyouwillneed:
- EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride).Thesolutionshouldbemadefreshmomentsbeforeuse.
- Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide).Thesolutionshouldbemadefreshmomentsbeforeuse.
- Sephadex®spincolumn.SephadexsizeexclusionspincolumncanbeusedforseparationofliposomesformfreeEDC(MW:191.70).SinceEDCisbeingseparatedfromlargeliposomeparticlesthenanysizesofSephadex®spincolumnsuchasG-10,G-15,G-25,G50canbeused.However,keepinmindthatyouwilllosealargepercentageofyourliposomesonthespincolumn.Alternatively,insteadofremovingtheEDCbyspincolumnyoucanquenchitbyusing2-mercaptoethanol.
- 2-Mercaptoethanol.ToquenchtheunreactedEDC,2-mercaptoethanolisaddedtoformastablecomplexwiththeremainingcarbodiimide.The2-mercaptoethanolmightnotbenecessaryifyouprefertocleanupyourliposomefromfreeEDCusingaspincolumn.
- Float-A-Lyzer®withaproperMWCOthateasilyallowsthecleanupofyourliposomeconjugatedligandfromfreeandnon-conjugatedprotein,peptideorantibody.YouneedtomakesurethattheMWCOisbelow1,000,000dalton.At1,000,000daltontheporesizeonthedialysismembranegetscloseto100nmandthereforeyourliposomescanbedialyzedout.Youcannotusedialysiscassettesblindly.Pleaseunderstandthetechniquebeforeusingeitherspincolumnordialysiscassette.IfyoudonotusethecorrectMWCOyoucanloseyourentireprep.Forthisprotocol,werecommendMWCOof300,000dalton.
PreparationMethod
Thetwo-stepprotocolincludestheactivationofcarboxylgroup-containingliposomeswithEDC/sulfo-NHS,andsubsequentconjugationwiththeaminegroupontheproteins,peptidesorantibodies:
- Inordertoactivatethecarboxylgroupsontheliposomes,EDCandsulfo-NHSshouldbeaddedtotheliposomes.ThetotallipidconcentrationinImmunosome®-Dodecanyl(Non-PEGylated)is22.45mM.1%molofthelipidinliposomescontainsCOOHgroupandonlyhalfofthemareexposedtotheoutsideoftheliposomes,whichisequalto0.11mMofreactiveconjugablelipid.For2mlvolumeliposome,thisisequalto2.20×10-7molandfor5mlvolumeliposome,thisisequalof5.50×10-7molofCOOH.Add10-foldmolarexcessofEDCand25-foldmolarexcessofsulfo-NHStoImmunosome®-Dodecanyl(Non-PEGylated).Toaidinaliquotingthecorrectamountofthesereagents,theymaybequicklydissolvedinthePBSbufferatahigherconcentration,andthenapropervolumeimmediatelyPipettedintotheproteinsolutiontoobtainthepropermolarquantities.
- Mixwellandallowthereactiontoproceedfor15minatroomtemperature.
- Beforeaddingtheprotein,peptideorantibody,removetheexcessEDCeitherusingasizeexclusionspincolumn,suchasSephadex®spincolumnorthroughquenchingby2-mercaptoethanolata20mMfinalconcentration.Additionof2-mercaptoethanolwillnotimpacttheliposomes.
- Dissolvetheprotein,peptideorantibodyat1-10mg/ml,dependingontheantibody,proteinorpeptide,inPBSorotheramine-free,carboxylatefreebuffer,pH7-8.
- Addtheprotein,peptideorantibodytotheEDC/Sulfo-NHSactivatedImmunosome®-Dodecanyl(Non-PEGylated)liposomes.Themolarratioofthereactivecarboxyllipidtoprotein,peptideorantibodyispreferredtobearound10:1.Thetotallipidconcentrationinourliposomesis22.45mM.1%molofthelipidinliposomescontainsCOOHgroupandonlyhalfofthemareexposedtotheoutsideoftheliposomes,whichisequalto0.11mMofreactiveconjugablelipid.For2mlvolumeliposomes,thisisequalto2.20×10-7molandfor5mlvolumeliposomes,thisisequalof5.50×10-7molofCOOH.Youwillneedtocalculatethetotalmolesofyourpeptide,proteinorligandinyoursolutionandadd1:10molarratioofligandtolipid.
- Mixwellandallowtoreactfor2hatroomtemperature.
- Removethenon-conjugatedprotein,peptideorantibodyfromtheimmunoliposomesbydialysis.Wepreferdialysistosizeexclusioncolumns.Dialysisisamuchslowerprocessbuttherewillbeminimumlossofimmunoliposomesaftertheprepiscleanedfromnon-conjugatedprotein/peptide/ligand.Spincolumnsaremuchfaster;however,youcaneasilyloseover50%oftheliposomesonthespincolumn.WerecommendusingFloat-A-Lyzer® dialysiscassettefromSpectrumLabs.YouwillneedtochooseacassettewithproperMWCOdependingontheMWofyourprotein,peptide,antibodyorantibodyfragment.NOTE:Ifyoudecidetouseadialysiscassette,youwillneedtomakesurethattheMWCOisbelow1,000,000dalton.At1,000,000dalton,theporesizeonthedialysismembranegetscloseto100nmandtherefore,yourliposomescanbedialyzedout.Youcannotusedialysiscassettesandspincolumnsblindly.Theycomeinvarioussizesandyouneedtochoosethecorrectsizewisely.Dialyzetheimmunoliposomesolutionin1literofPBSatpH7.4for8hours.Changethedialysisbufferwithafresh1literofPBSandletisdialyzeforanother8hours.Afterthisstep,yourcleanedupimmunoliposomeisreadytobeused.
LiposomeParticleCalculator
Immunosomesareunilamellarliposomesandsizedto100nm.Themolarconcentrationofliposomeis22.45mM.Byhaving liposomediameter(nm)andlipidconcentration(µM),youcancalculatethetotalnumberofthelipidsinoneliposomeandthenumberoftheliposomesinonemilliliteroftheliposomesolution.Tousethecalculatorclick here.
TechnicalNotes
- EDCandsulfo-NHSshouldbepreparedimmediatelybeforeuseandkeptatroomtemperature.
- TheactivationreactionwithEDCandSulfo-NHSismostefficientatpH4.5-7.2,andEDCreactionsareoftenperformedinatpH4.7-6.0.Forthisreason,wehaveformulatedtheliposomesinPBSbufferandadjustedthepHto6.
- ReactionofSulfo-NHS-activatedmoleculeswithprimaryaminesismostefficientatpH7-8,andSulfo-NHS-esterreactionsareusuallyperformedinphosphate-bufferedsaline(PBS)atpH7.2-7.5.
- Trisbuffershouldneverbeusedinanystepoftheprocesssinceitcontainsamine.
- IfyouareusingaligandorpeptidethatishydrophobicthenitisrecommendedtosolubilizeitinDMSOorDMFandthenaddthebuffertoit.Itisrecommendednottousemorethan5%volumeofDMSOorDMFinthesolution.DMFandDMSOarebothcompatIBLewithliposomesandtheyarealsomiscibleinwater.Otherorganicsolventsuchasethanolandchloroformarenotcompatiblewithliposomesandwillcausetheliposomestolyse.IfyouendupusingDMSOorDMFthenaftertheconjugationreactionisdone,youneedtoremoveDMSOandDMFfromtheliposomes.InordertodothatyouneedtouseadialysiscassettethatismadefromREGENERATEDCELLULOSEMEMBRANE.NOTE:NotallmembranesarecompatiblewithDMFandDMSO.WerecommendusingaSlide-A-Lyzer™MINIDialysisDevicewithMWCOof2KmadefromregeneratedcellulosemembranemanufacturedbyThermofisher.AfterDMSOorDMFisremoved,youcanuseFloat-A-Lyzer®dialysisdeviceforthefinalstepofcleaninguptheprep.
- Liposomesshouldbekeptat4°CandNEVERbefrozen.
Database
Directlinktothedatabasepageforeasynavigation:ImmunoliposomesConjugationDatabase
Appearance
Immunosome®-Dodecanylisawhitetranslucentliquidmadeofnanosizeunilamellarliposomes.Usuallyduetothesmallsizeofliposomesnosettlingwilloccurinthebottomofthevial.Theliposomesarepackagedinanambervial.
Ordering/ShippingInformation
- Allliposomebasedformulationsareshippedonblueiceat4°Cininsulatedpackagesusingovernightshippingorinternationalexpressshipping.
- LiposomesshouldNEVERbefrozen.Icecrystalsthatforminthelipidmembranecanrupturethemembrane,changethesizeoftheliposomesandcausetheencapsulateddrugtoleakout.Liposomesinliquidformshouldalwaysbekeptintherefrigerator.
- ClientswhoorderfromoutsideoftheUnitedStatesofAmericaareresponsiblefortheirgovernmentimporttaxesandcustomspaperwork.EncapsulaNanoSciencesisNOTresponsibleforimportationfeestocountriesoutsideoftheUnitedStatesofAmerica.
- WestronglyencouragetheclientsinJapan,Korea,TaiwanandChinatoorderviaadistributor.Toughcustomsclearanceregulationsinthesecountrieswillcausedelayincustomclearanceoftheseperishableformulationsifordereddirectlythroughus.Distributorscaneasilyclearthepackagesfromcustoms.Toseethelistofthedistributorsclickhere.
- ClientsorderingfromuniversitiesandresearchinstitutesinAustraliashouldkeepinmindthattheliposomeformulationsaremadefromsyntheticmaterialandtheformulationsdonotrequirea“permittoimportquarantinematerial”.LiposomesareNOTbiologicalproducts.
- Ifyouwouldlikeyourinstitute’sFedExorDHLaccounttobechargedforshipping,thenpleaseprovidetheaccountnumberatthetimeofordering.
- EncapsulaNanoScienceshasnocontroloverdelaysduetoinclementweatherorcustomsclearancedelays.YouwillreceiveaFedExorDHLtrackingnumberonceyourorderisconfirmed.ContactFedExorDHLinadvanceandmakesurethatthepaperworkforcustomsisdoneontime. AllsubsequentshippinginquiriesshouldbedirectedtoFederalExpressorDHL.
StorageandShelfLife
Storage
Immunosome®productsshouldalwaysbestoredatinthedarkat4°C,exceptwhenbroughttoroomtemperatureforbriefperiodspriortoanimaldosing.DONOTFREEZE.IfthesUSPensionisfrozen,theencapsulateddrugcanbereleasedfromtheliposomesthuslimitingitseffectiveness.Inaddition,thesizeoftheliposomeswillalsochangeuponfreezingandthawing.
ShelfLife
Immunosome®-Dodecanylismadeondailybasis.Thebatchthatisshippedismanufacturedonthesameday.Itisadvisedtousetheproductswithin4monthsofthemanufacturingdate.
ReferencesandbackgroundreADIng
1.HermansonGT.Bioconjugatetechniques.Academicpress;2013Jul25.
2.TorchilinV,WeissigV,editors.Liposomes:apracticalapproach.OxfordUniversityPress;2003Jun5.
3.GrabarekZ,GergelyJ.Zero-lengthcrosslinkingprocedurewiththeuseofactiveesters.Analyticalbiochemistry.1990Feb15;185(1):131-5.
4.YanL,CraytonSH,ThawaniJP,AmirshaghaghiA,TsourkasA,ChengZ.ApH‐ResponsiveDrug‐DeliveryPlatformBasedonGlycolChitosan–CoatedLiposomes.Small.2015Oct1;11(37):4870-4.
5. Silva-LópezEI,EdensLE,BardenAO,KellerDJ,BrozikJA.ConditionsforliposomeadsorptionandbilayerformationonBSApassivatedsolidsupports.Chemistryandphysicsoflipids.2014Oct31;183:91-9.
6.HazraM,SinghSK,andRayS.SurfaceModificationofLiposomalVaccinesbyPeptideConjugation.JournalofPharmaSciTech,2011;1(1):41-47.
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2018-12-26
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2021-09-16
采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠IL-3单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-3与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠IL-3，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与 查看更多
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2021-08-01
v:* {behavior:url(#default#VML);}o:* {behavior:url(#default#VML);}w:* {behavior:url(#default#VML);}.shape {behavior:url(#default#VML);}st1:*{behavior:url(#ieoo 查看更多
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2018-12-26
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2021-07-25
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2018-12-26
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2018-12-26
采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠ENA-78/CXCL5单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的ENA-78与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠ENA-78，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Stre 查看更多
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2018-12-26
采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠C-peptide单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的C-peptide与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠C-peptide，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的S 查看更多
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2018-12-26
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2018-12-26
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2021-09-04
采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠IL-12单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-12与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠IL-12，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 查看更多
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直接竞争ELISA与间接竞争ELISA的原理区别 生物科学论坛...123
LJX372018-01-17
直接竞争ELISA和间接竞争ELISA区别
1、直接竞争，标记抗原，与检测样品中的抗原竞争抗体。
2、间接竞争，标记抗体，固相抗原与液相抗原（样品）竞争标记抗体。
3、定义
间接竞争法的模型：包被抗原，用HRP-抗体与样本一起加入。样本中的Ag与Solid-Ag竞争HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab与样本中的Ag浓度成反比。
直接竞争法的模型：包被抗体，用HRP-抗原与样本一起加入。样本中的Ag与HRP-Ag竞争Solid-Ab，固相吸附的HRP-Ag与样本中的Ag浓度成反比。
4、竞争法的理论基础：是限量抗体。只有在限量抗体基础上，两种抗原才会形成竞争关系。
5、、间接竞争法具备较高灵敏度原因。
直接竞争法里，标记抗原与待测抗原均是液相，与抗体的结合机会是一样的，例如有1份标记抗原与1份待测抗原竞争1份抗体，那么有50%的标记抗原能与抗体结合，所以标记抗原的相对结合率为50%。间接法里，固相抗原与抗体的接触面积较小，固相抗原与待测抗原的结合抗体机会是不平等的，接近顺序饱和法，即只有与待测抗原结合剩余的抗体才会与固相抗原结合，同样有1份固相抗原与1份待测抗原竞争1份抗体时，基本上抗体会被待测抗原中和掉，与固相抗原结合的抗体非常少。固相抗原的相对结合率为0%。因此，间接法的抑制曲线斜率会大于竞争法。
因为抑制率越大则斜率越大，从而灵敏度越大。（假设零管变异5%，以两倍SD为灵敏度限，则为90%相对结合率，则间接法可以在较低的待测抗原浓度达到这一相对结合率，因此灵敏度要高。）
在进行系统放大时，间接法一般可以使用酶标二抗。因为二抗可以针对抗体的多个部位，所以存在放大效应，从而能提高间接法的灵敏度。直接法一般难以进行放大，常用的有生物 素化抗原与酶标亲和素，但模式上似乎不存在放大效应。
6、间接法的高灵敏度难以实现的原因：
双抗体 夹心的免放（IRMA）模式刚出现时，也被模型证明灵敏度优于竞争法的放免（RIA），原因也是较大的斜率，但是IRMA的高灵敏度一直到单抗发展后才得以实现。
1、直接竞争，标记抗原，与检测样品中的抗原竞争抗体。
2、间接竞争，标记抗体，固相抗原与液相抗原（样品）竞争标记抗体。
3、定义
间接竞争法的模型：包被抗原，用HRP-抗体与样本一起加入。样本中的Ag与Solid-Ag竞争HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab与样本中的Ag浓度成反比。
直接竞争法的模型：包被抗体，用HRP-抗原与样本一起加入。样本中的Ag与HRP-Ag竞争Solid-Ab，固相吸附的HRP-Ag与样本中的Ag浓度成反比。
4、竞争法的理论基础：是限量抗体。只有在限量抗体基础上，两种抗原才会形成竞争关系。
5、、间接竞争法具备较高灵敏度原因。
直接竞争法里，标记抗原与待测抗原均是液相，与抗体的结合机会是一样的，例如有1份标记抗原与1份待测抗原竞争1份抗体，那么有50%的标记抗原能与抗体结合，所以标记抗原的相对结合率为50%。间接法里，固相抗原与抗体的接触面积较小，固相抗原与待测抗原的结合抗体机会是不平等的，接近顺序饱和法，即只有与待测抗原结合剩余的抗体才会与固相抗原结合，同样有1份固相抗原与1份待测抗原竞争1份抗体时，基本上抗体会被待测抗原中和掉，与固相抗原结合的抗体非常少。固相抗原的相对结合率为0%。因此，间接法的抑制曲线斜率会大于竞争法。
因为抑制率越大则斜率越大，从而灵敏度越大。（假设零管变异5%，以两倍SD为灵敏度限，则为90%相对结合率，则间接法可以在较低的待测抗原浓度达到这一相对结合率，因此灵敏度要高。）
在进行系统放大时，间接法一般可以使用酶标二抗。因为二抗可以针对抗体的多个部位，所以存在放大效应，从而能提高间接法的灵敏度。直接法一般难以进行放大，常用的有生物 素化抗原与酶标亲和素，但模式上似乎不存在放大效应。
6、间接法的高灵敏度难以实现的原因：
双抗体 夹心的免放（IRMA）模式刚出现时，也被模型证明灵敏度优于竞争法的放免（RIA），原因也是较大的斜率，但是IRMA的高灵敏度一直到单抗发展后才得以实现。
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说明微生物糖发酵实验的原理及结果分析。_123
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针对于HBeAb的中和抑制法
采用抗-HBe抗体包被反应板，加入校准品及被测样本，同时加入定量HBeAg中和抗原，经过振荡孵育,洗板后再加入铕标记的抗-HBe，若标本中抗-HBe浓度高，HBeAg将被大量中和，使最后形成的抗-HBe-HBeAg-铕标记抗-HBe复合物减少。增强液（β－NTA）将标记在抗体上的Eu3+解离到溶液中，Eu3+和增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物，荧光强度和样本中的抗-HBe浓度成反比。
采用抗-HBe抗体包被反应板，加入校准品及被测样本，同时加入定量HBeAg中和抗原，经过振荡孵育,洗板后再加入铕标记的抗-HBe，若标本中抗-HBe浓度高，HBeAg将被大量中和，使最后形成的抗-HBe-HBeAg-铕标记抗-HBe复合物减少。增强液（β－NTA）将标记在抗体上的Eu3+解离到溶液中，Eu3+和增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物，荧光强度和样本中的抗-HBe浓度成反比。
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为什么HBeAbHBcAb的ELISA要用竞争法呢？加样快慢差异很大，不能用其他方法吗？谢谢
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【求助】竞争法ELISA的标准曲线 免疫学讨论版123
liuhua2018-01-17
大多数国产试剂盒生产厂家会提供对数坐标纸，可直接手工绘制曲线；如果酶标仪带有分析软件，可由软件直接拟合曲线，并自动计算出样本的浓度值；老式的酶标仪只能打印出OD值，需要实验员自己绘制曲线并计算，下面介绍2种绘制竞争法曲线的方法，希望对大家有帮助：一、在对数坐标纸上手工绘制曲线（Log-logit双对数标准曲线）1.实验做双孔，实验结果如下表所示。标准点浓度OD1OD2OD均结合率S002.2262.1922.209S10.11.7251.6791.70277.0%S20.41.3131.3381.325560.0%S31.60.9070.8340.870539.4%S46.40.5170.5170.51723.4%S525.60.2300.2440.23710.7%2）各标准点吸光值取均值。在表中OD均一列。3）将S1~S5的OD均值与S0的OD均相除，为标准点的百分结合率。4）在log-logit坐标纸上绘图。5）坐标纸上横轴从左至右第一个1-9表示为第一个10进位，第二个1-9表示为第二个10进位。第三个1-9表示为第三个10进位。也就是说，如果第一个1代表1ng/ml，则第二个1代表10ng/ml，第三个1代表100ng/ml。因为本次实验标准曲线范围是从0.1ng/ml到25.6ng/ml，则可以用第一个1代表0.1ng/ml，第二个1代表1ng/ml，第三个1代表10ng/ml。6）坐标纸纵轴为百分比。即各标准吸光值的百分结合率。7）曲线第一个数值点是（0.1，77.0%）。则在横轴左起点的1处向上至70~80之间，由70向上7个小格处。8）曲线第二个数值点是（0.4，60.0%）。则在横轴左起第一个4，向上至60的位置。9）曲线第三个数值点是（1.6，39.4%）。则在横轴左起第二个1至2之间，由第二个1向右6个小格。再向上至30~40之间，由30向上9个半小格处。10）曲线第四个数值点是（6.4，23.4%）。则在横轴左起第二个6至7之间，这里6与7之间分为5小格，则每个小格是0.2。所以由第二个6向右2个小格。再向上至20~30之间，由20向上约3个半小格处。11）曲线第四个数值点是（25.6，10.7%）。则在横轴左起第三个2至3之间，这里2与3之间分为10小格，则每个小格是1。所以由第三个2向右5个半小格。再向上至10~20之间，由10向上约半小格处。12)画一条通过各点的直线。要求尽可能多的点在线上，同时剩余的点均匀分布在直线的两边。13）样品也同样由吸光值计算百分结合率，再从纵轴上的相应结合率找到直线上的点，此点对应的横坐标浓度即为样品的浓度。无须换算。本数据来源于百度地图，最终结果以百度地图最新数据为准。
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