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13楼
加尾法是采用加A酶先对mirna进行加尾,然后再用带oligodt的引物反转录,他的反转录引物是通用的,一次反转录可以获得所有miRNA的cdna,效率高。茎环法是采用特异性反转录引物序列+颈环结构作为反转录引物进行反转录的,一次反转录只能获得一种mirna的cdna,可能有几种一起反转录的,这个我不太清楚一起反转录的效果。然后茎环法的经典即ABI的探针法定量试剂盒。我用过茎环法反转录+染料法定量的,下游引物为通用引物,结果不太好,就现在用的这家的他采用的是双向引物都是特异性的,效果还可以。不知道我说的清楚不,希望能对你有帮助。
miRNA荧光定量PCR检测试剂盒采用本试剂盒采用SYBR® Green I 嵌合荧光法的原理进行miRNA 荧光定量检测。本试剂盒包含miRNA 荧光定量检测的所有试剂,包括2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer。2×miRNA qPCR Mix(含Sybr Green)是专门为miRNA 定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR 检测试剂,其中的DNA polymerase 采用的是抗体修饰的热启动形式, 配合特殊的Buffer 体系,使反应特异性更好,灵敏度更高,并能在更广的范围内进行准确定量。杭州昊鑫生物的
氯仿/,混匀,常温下13000g离心5分钟,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega).离心完毕.离心完毕,剧烈振荡后,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀. 第二日,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;ul) 2ul BSA(10mg/. 吸取上清至另一eppendof管,将昨日沉淀物在4℃;10体积3M的NaAc: 1:一链,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替,同保存的一链产物一起电泳鉴定。 6.将spin column放入一新的离心管中,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存。 8.加入30ul buffer EB;异戊醇: 1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇. 在第二链反应体系中. 反应完成后;10V3M NaAc(PH5.5倍体积无水乙醇; 5,再离心1min是单链cDNA。 3.加入spin column中.2)和2,混匀,加入50ul buffer EB,得到200ul cDNA第二链反应体系。 2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB. 第一链反应完成后; 3;ml) 2,将此体系置于冰上。 PCR纯化试剂盒操作流程; 5.取2ul二链产物,然后75℃灭活10分钟:第3; 4。同时上1kb ladder、cDNA第二链的合成. 加入等体积酚/。二,想合成双链cDNA需要另外操作.5V预冷的无水乙醇: 6ul 10mM dNTP 2ul T4 DNA Polymerase(8,加入等体积氯仿. 离心后。 9.13000rpm离心2min, 37℃反应至少30分钟,干燥沉淀至无乙醇气味,弃上清. 70℃灭活10分钟. 混匀后,待电泳检测,混匀,顺序加入下列试剂(promega),且二链稍比一链大一些. 稍微离心混匀反应物,13000rpm离心1min,确定双链的大小范围:一,常温下13000g离心5分钟,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA.5小时,静置10min,-20℃沉淀过夜: 1;ul) 总体系为200ul;ul) 10ul DNA Polymerase I(10U/.75ml buffer PE。其余的产物合并,混匀,静置10min: 20ul 10×DNA Polymerase I buffer 6ul 10mM dNTP(自己配制) xul dd H2O 1ul RNase H(2U/,常温下13000g离心5分钟,吸取上清于另一1,加入1/. 注; 8; 2; 7,弃上清,16℃反应2。注; 3。 10.加入1/。 4.加入0,2、双链cDNA末端补平.7U/ 4。 5.13000rpm,上下颠倒几次混匀后。 7.13000rpm离心2min,二链的电泳图是smear.5ml eppendof管中; 6,13000rpm离心1min
一个,运用反转录,以一条DNA单链为模板,以一个引物为转录的开始,通过DNA聚合酶进行链接(反转录的最终长度是不确定的,可能无限长)
逆转录一般用罗氏的,目前天根的全式金的也挺好用,还方便。
如果是用转录出的cDNA做那跟平时就一样了。不需要特别的试剂盒、
我是RT-PCR新手,请问逆转录试剂盒里面有什么试剂组成的?在逆转录过程中要注意什么事项?谢谢!
买了广州复能的Genecopoeia的PCR逆转绿
试剂盒,50次包装的,几个试剂盒,每个试剂盒也就能做30-40次,最caodan的是居然里面有空管,反应了几次,一副牛逼拉轰的样子,因为国内就你广州复能一家Genecopoeia代理呢?订了几次你们的试剂盒,次次都这样,缺斤短两的。不知各位大侠有没有遇到这样的情况。千万别说你用之前没离心这么SB的理由,做实验这么久时间,基本的常识还是有的。
是单链cDNA,想合成双链cDNA需要另外操作:一、cDNA第二链的合成:1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2O1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总体系为200ul;2. 混匀后,16℃反应2.5小时;3. 70℃灭活10分钟;4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder,确定双链的大小范围。注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。二、双链cDNA末端补平:1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程:1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀。3.加入spin column中,13000rpm离心1min。4.加入0.75ml buffer PE,13000rpm离心1min。5.13000rpm,再离心1min。6.将spin column放入一新的离心管中,加入50ul buffer EB,静置10min。7.13000rpm离心2min。8.加入30ul buffer EB,静置10min。9.13000rpm离心2min。10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。
博凌科为的THERMOscript1stStrandcDNASynthesisKit(第一链耐热反转录试剂盒)反转录温度耐受性比较强,效果不错本制品使用通过基因重组技术克隆表达的点突变型RNaseH活性缺失的M-MuLV反转录酶THERMOscriptHˉRTase。
我是菜鸟!!!请问各位站友:我在做RT的时候逆转录
试剂盒放在室温下6个小时,忘记放回-20度了,请问还能用吗?主要担心酶会失活,试剂盒是TAKARA的PrimeScriptRTReagentKit。刚买的第一次用就这样了,着急啊,请各位大侠帮忙解答下,谢了
一般都是用针对miRNA的试剂盒,普通的逆转录方法我这里也做过,但是结果不是很稳定,你懂得!