ProductDescription
TeloCol®-3bovinecollagensolutionisderivedfromanacidextractionprocessyieldingatelopeptide-intactcollagen.Thepro-peptideregionsatbothendsofthecollagenchain,N-andC-telopeptideregions,aremaintained.
TeloCol®-3collagenisapproximately95%TypeIcollagenwiththeremainderbeingcomprisedofTypeIIIcollagen.Eachproductincludesabottlecontaining50mlofcollagensolutionaccompaniedwithabottleofpre-formulatedneutralizingsolutionfortheformationofacollagengel.Thisproductissuppliedataconcentrationofapproximately3mg/ml.TeloCol®-3issterilefilteredandprovidedinuser-friendlypackagingforuseandstorage.
TeloCol®-3isidealforcoatingofsurfaces,providingpreparationofthinlayersforculturingcells,oruseasasolidgel.
Parameter,Testing,andMethod | TeloCol®-3TypeICollagen#5026 |
SterilizationMethod | Filtration |
ExtractionMethod | Acid-telocollagen |
Form | Solution |
PackageSize | 50mLKit |
StorageTemperatureofCollagen | 2-10°C |
StorageTemperatureofNeutralizationSolution | RoomTemperature |
ShelfLife | Minimumof6monthsfromdateofreceipt |
CollagenConcentration-Biuret | 2.8-3.3mg/mL |
CollagenPurity-SilverStaining | >99% |
pH | 1.9-3.0 |
KineticGelTest(Minutes) | <40 |
GelFormationTubeTest(Minutes) | <40 |
Fibrillogenesis(AbsorbanceUnits) | >0.35 |
ElectrophoreticPattern-CoomassieBlue | Characteristic |
Sterility-USPmodified | Nogrowth |
Endotoxin-LAL | <10.0EU/mL |
Osmolality(mOsmoH2O/kg) | <35 |
CellAttachmentAssay | Pass |
Source | BovineHide |
HydrogelYoung"sModulusE(Pa) | Characteristic |
DirectionsforUse
DownloadthefullPDFversionorcontinuereADIngbelow:
Note:Employasepticpracticestomaintainthesterilityoftheproductthroughoutthepreparationandhandlingofthecollagenandothersolutions.
CoatingProcedure
- TransferdesiredvolumeofTeloCol®-3collagensolutionfromthebottletoadilutionvesselifrequired.Furtherdilutetodesiredconcentrationusingsterile0.01NHClsolution.Swirlcontentsgentlyuntilmaterialiscompletelymixed.Atypicalworkingconcentrationmayrangefrom50to100ug/ml.Note:Usetheserecommendationsasguidelinestodeterminetheoptimalcoatingconditionsforyourculturesystem.
- AddappropriateamountofdilutedTeloCol®-3collagentotheculturesurfaceensuringthattheentiresurfaceiscoated.
- Incubateatroomtemperature,covered,for1-2hours.Aspirateanyremainingmaterial.Alternatively,incubateatroomtemperatureuntilsurfaceisdry.
- RinsecoatedsurfacescarefullywithsterilemediumorPBS,avoidscratchingsurfaces.
- Coatedsurfacesarereadyforuse.Theymayalsobestoredat2-8°Cdamporairdriedifsterilityismaintained.
3-DGelPreparationProcedureusingthesuppliedNeutralizationSolution
Note:Itisrecommendedthatthecollagenandotherworkingsolutionsbechilledandkeptoniceduringthepreparationofthecollagen.
- Determinethedesiredvolumeofcollagenrequired.
- Transfer1partofchilledneutralizationsolutionintoasterilemixingvesselortube.
- Transfer9partsoftheTeloCol®-3collagenintothesterilemixingvesselortubeforatotalof10parts.
- Gentlyagitatethemixtureorpipetupanddowntomix.Vortexingisnotrecommended.
- Dispensethecollagenmixtureinthedesiredsterileplatesorculturevessels.
- Incubateat37°Cfor1hourforgelformation.
3-DGelPreparationProcedurewithoutusingthesuppliedNeutralizationSolution
Note:Itisrecommendedthatthecollagenandotherworkingsolutionsbechilledandkeptoniceduringthepreparationofthecollagen.
- Slowlyadd1partofchilled10XPBSor10Xculturemediato8partsofchilledcollagensolutionwithgentleswirling.
- AdjustpHofmixtureto7.2–7.6usingsterile0.1MNaOH.MonitorpHadjustmentcarefully(pHmeter,phenolred,orpHpaper).Mixwithgentleswirling.
- Adjustfinalvolumetoatotalof10partswithsterilewaterandmix.
- Topreventgelation,maintaintemperatureofmixtureat2–10°C.
- DispensetheTeloCol®-3collagenmixtureinthedesiredsterileplatesorculturevessels.
- Toformgel,warmto37°C.Allowapproximately30to60minutesforgelformation.
ProductQ&A
WecompletedastudytoshowthatDNAiscompletelydestroyedatpH2,anddemonstratedthatourcollagenproductsdonotcontainDNA.
Thecollagenisfullyhydrolyzed.TheaminoacidanalysisisdoneusingtheWatersAccQ-Tagderivatizationmethod.Duringtheacidhydrolysisstep,asparagine(N)isconvertedtoasparticacid(D)andglutamine(Q)isconvertedtoglutamicacid(E).Tryptophan(W),ifpresent,isdestroyedduringacidhydrolysis.Experimentally,onecandeterminethepicomoles(pmol)ofeachaminoacidperinjecteddetectedusingaminoacidstandards.Fortheconcentrationdetermination,thetotalnumberofpmolofeachaminoacidissummedtogetthetotalpmolofthe18aminoacidsdetected.Thetotalpmolaminoacidsisdividedbythetheoreticalnumberofaminoacidresiduesincollagenbasedonthepublishedsequence.Theresultisthepmolofcollageninjected.Theresultisthenmultipliedbythedilutionand300,000isusedasthecollagenmolecularweighttogettomg/mL.Themolecularweightofcollagenisnotwellagreedupon.
Dilutingwith1XPBS(ratherthanwateror0.01NHCl)wouldhaveaneffectforcoatingpurposes.ItwouldchangethepHofthedilutedcollagensolutionfromacidtoneutralpH.ThepHchangewilltransformthecollagenmoleculesfromamolecularformtoafibrillarform;andthenthenatureofcoatingsurfacewillbechangedfromamonomericcoatingtoafibrillarcoating.
WeusethefollowingantibodiesfromSouthernBiotech:
1.1310-02–GoatAnti-TypeICollagen-FITC
2.1310-08–GoatAnti-TypeICollagen-BIOT
3.7100-05–Streptavidin-HRP
ThemajorcollagenmolecularspeciesinourTypeIcollagenproductsaremonomers(approx.70%),buttherearedimers,trimersandafewpercentagesofoligomerstoo(approx.30%)withsomeminoramountsofcollagenfragments.Thecollagenmonomerisarodshapedmoleculewith300nminlengthand1.5nmindiameter.Thedimer,trimerandoligomerare600nm,900nmandevenlongerinlengthrespectively.Accordingtothecoatingprocedures,thecollagenmoleculesareattachedtothechargedpolystyrenesurfacerandomlybychargeoraffinityinacidconditionsduringthe1-2hrsincubationperiodat37°C,andanyunattachedmaterialsareremovedbyaspirationandrinsing.Therefore,thecoatedsurfaceisasinglelayerofcollagenmonomer,dimer,trimerandoligomermixtures.Thethicknessofthemono-molecularlayerisdependentonhowthosemoleculesareattachedonthesurface.Thecoatingdensitythicknesswouldgenerallybecharacterizedasa1moleculethicknesswhichcouldberangingfromafewnanometerstoafewhundrednanometerswiththewholesurfacebeingcoveredbycollagen.
ThenetchargeofTypeIcollagenproducts’(PureCol®,BovineCollagenandVitroCol®,HumanCollagen)moleculeisdirectlyrelatedtothepH.AtanacidicpH,theaminoacids(zwitterions)alongthecollagenmoleculearepositivelycharged,makingtheentirecollagenmoleculepositive.Attheisoelectricpoint(orzone)ofcollagen,aroundpH7-8,theaminoacidsalongthecollagenmoleculearepositivelyandnegativelycharged,makingthenetchargeofthecollagenmoleculeclosetozero.AtabasicpH,theaminoacidsalongthecollagenmoleculewerenegativelycharged,makingtheentirecollagenmoleculenegative.
Further,thenatureofthechargeofthecollagencoatingsurfacewillbedependentonthetypeofcoatingapplied.ForamonomericcollagencoatingswhenthecollagenisappliedunderanacidicpHcondition,thesurfaceispositivelycharged.IfthesurfaceisrinsedwithpHneutralbufferormediathenitwillchangethechargeofthecollagensurfacenetchargeclosetozero.Fora3Dgelcoating,thecollagenpreparedunderneutralpH;thenetchargeofthecollagensurfaceisclosetozero.
Usingrotaryshadowingtechniqueundertransmissionelectronmicroscopy,itwasfoundthatourcollagen,onaverage,consistsofapproximately80%monomers,13%dimers,trimers,andoligomerswiththeremaining7%collagenfragments.
Yes.ThecollagenmoleculeinPureCol,Nutragen,VitroCol,andallofourotherAtelocollagenproductswerepreparedfromnativecollagenmatrixbypepsintreatmentundercontrolledconditionstoremovethenon-helicalportion,telo-peptides,onlyandthehelicalportionisintact.Inthiscase,theenzymaticactivesitesforMMP(MatrixMetalloproteinase),suchasforMammalianCollagenaseMatrixMetalloproteinase8(MMP-8),onthemoleculewaspreserved.
Thesepepsintreatedcollagenproductsshouldbehaveasnativeintactcollagen.
TGFbetawouldhavebeendigestedwiththepepsinenzymaticdigestionstep.ItwasundetectablebySDSPAGEsilverstainaswell.Wedidn’tdoanyspecificmeasurementsbyELISAhoweverbutpresencesofTGFbetaisnotanticipated.
WeprimarilyusetheBiuretmethod,butwealsouseBCA,AAA,andhydroxyl-prolineassays.
-Collagensolutionsthatarefrozentendtohaveissuesforming3Dhydrogels,andwilllikelynotwork.Thesolutionsshouldstillbegoodfor2Dcoatings.
-Collagensolutionsthatareleftoutatroomtemperatureforextendedperiodsoftimemayshowsignsofdegradation,whichwillaffecttheformationof3Dhydrogels.Itislikelystillfinefor2Dcoatings.
Ourrecommendationisthis:Ifyouareusingtheproductdirectlyforapublication,wehighlysuggestbuyinganewbottleiftheoneyouhavewascompromised.
ProductReferences
ReferencesforTeloCol®:
Drzewiecki,KathrynE.,etal.“CircularDichroismSpectroscopyofCollagenFibrillogenesis:ANewUseforanOldTechnique.”BiophysicalJournal,vol.111,no.11,2016,pp.2377–2386.,doi:10.1016/j.bpj.2016.10.023
Wingender,Brian,etal.“BiomimeticOrganizationofCollagenMatricestoTemplateBone-likeMicrostructures.”MatrixBIOLOGy,vol.52-54,2016,pp.384–396.,doi:10.1016/j.matbio.2016.02.004.
Burla,F.,Tauber,J.,Dussi,S.,Gucht,J.V.D.&Koenderink,G.H.Stressmanagementincompositebiopolymernetworks.NaturePhysics15,549–553(2019).
ProductCertificateofAnalysis
ProductVideos
TelovsAteloCollagen
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NeutralizationSolutionforEasy3DCollagenGels
Video
CollagenConcentrationvsGelStiffness
Video
4KeyComponentsfor3DCollagenGels
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HowtoMake3DCollagenHydrogels
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SeedingCollagenGelswithCells
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CoatingaGlassCoverslipwithCollagen
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SafetyandDocumentation
SafetyDataSheet
CertificateofOrigin
DeclarationofMaterialSource
ProductDisclaimer
ThisproductisforR&Duseonlyandisnotintendedforhumanorotheruses.PleaseconsulttheMaterialSafetyDataSheetforinformationregardinghazardsandsafehandlingpractices.
美国AdvancedBioMatrix(简称ABM) www.advancedbiomatrix.comAdvancedBioMatrix(简称ABM)是美国一家著名的生物公司,获得了AllerganInc的授权(Allergan用25年时间不断完善胶原蛋白相关的产品的生产工艺),将Allergan的专业和技术用于蛋白生产与检测,致力于为组织工程、细胞分析及细胞增殖等研究领域提供优质稳定的产品。AdvancedBioMatrix不断丰富已有产品线,目前可为三维细胞培养提供各种胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、水性凝胶、不同粘度与分子量的透明质酸以及低代成纤维细胞等。在美国全部产品授权Sigma销售。AdvancedBioMatrix是组织培养,细胞分析和细胞增殖三维(3D)应用的生命科学领域的领导者。我们的产品被公认为纯度,功能性和一致性的标准。我们在生产,分离,纯化,冷冻干燥,细胞培养和蛋白质测试,粘附肽,附着因子,底物刚性和其他3D矩阵产品方面拥有丰富的专业知识。我们的专业技术和知识正在被用来确保我们的产品质量最高,批次之间一致且易于为我们的研究客户使用。
美国AdvancedBioMatrix是3D组织培养、细胞检测和细胞增殖等领域实验解决方案的佼佼者。AdvancedBioMatrix在分离、纯化、冻干、细胞培养和蛋白检测、多肽粘附、附着因子、基质硬度和其他3Dmatrix 产品开发方面有着丰富的经验。AdvancedBioMatrix的研发经验和专业知识确保其产品可达到最佳质量,并保证产品之间一致性,方便研究客户使用。以下为AdvancedBioMatrix3DMatrices 产品竞争优势:1. 提供高纯度和成分确定的胞外基质;2. 超过1000余篇文献引用PureCol产品,品质非常均一;3. 在3D培养基领域可提供最全面的产品线;4. 唯一可提供特异性刚性有机硅基板的公司(CytoSoft);5. 唯一可提供可溶性丝纤蛋白的供应商(可运用于多种3D培养);6. 如果客户首次接触3D胶原凝胶,AdvancedBioMatrix还是唯一的预制胶原蛋白(PureColEZGel)供应商;
以下产品为AdvancedBioMatrix全球畅销品:1.PureCol 牛源I型胶原蛋白 3mg/ml#5005-100ML2.Nutragen牛源I型胶原蛋白 6mg/ml#5010-50ML3.FibriCol 牛源I型胶原蛋白 10mg/ml#5133-20ML4.VitroCol 人源I型胶原蛋白 #5007-20ML5. 弹性蛋白原 #5052-1MG6.ECMSelectArraykitUltra-36#5170-1EA7.CytoSoft(刚性可变的基底,AdvancedBioMatrix最新添加产品5190-7EA)8. 人III型胶原蛋白 #5021-10MG9. 人IV型胶原蛋白 #5022-5MG10.SilkFibroin溶液 #5154-20ML11.Fibronectin#5080-5MG12.Vitronectin#5051-0.1MG
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cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
RACE的优点
与筛库法相比较,有许多方面的优点
1)此方法是通过PCR技术实现的,无须建立cDNA文库,可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2)节约了实验所花费的经费和时间。
3)只要引物设计正确,在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介
RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23-28个核苷酸序列信息,以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物(GSPs)。
RACE引物的设计:
基因特异性引物(GSPs)应该是:
23-28nt
50-70%GC
Tm值≥65度,Tm值≥70度可以获得好的结果
需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在,PCR的产物是特异性的。
反应中涉及到的一些事项
cDNA的合成起始于polyA RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA,背景会很高。
RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外,重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50-70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列,否则会产生回折和
如果要用重叠片段来检测设计的引物,GSp1和GSp2之间至少是100-200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中,退火温度高于AP1引物的Tm值,可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度,可以进行随后的PCR循环。
形成分子内氢键。另外,避免使用与AP1互补的引物,尤其是在3‘末端。
验证基因特异性引物的对照:
单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物,应该改变循环的参数,或重新设计原始引物。
利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达,利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段,应该重复cDNA的合成,或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
制备和抽提polyA RNA
不要使用DEPC处理过的水。
纯化完mRNA之后,利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5-12kb的拖带,在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。
具体的实验步骤
cDNA第一条链的合成:
我们建议进行cDNA合成的对照反应,这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后,在气浴中42度保温一个小时。
注意: 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积,从而降低第一链的合成效率。
将管放于冰上,以终止第一链的合成反应。
直接进行第二链的合成。
cDNA第二链的合成:
第二链合成的酶混合物中,含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照,试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。
建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5-3kb之间。
通过电泳检测cDNA的产量,与对照进行对比,这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。
接头的连接及连接产物的稀释
按照程序进行连接反应。
如果没有对比样品和对照的产量,利用Tricine-EDTA buffer制备接头连接的ds cDNA的1/50和1/250的稀释物,用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应,直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。
RACE-PCR扩增
进行5’和3’的RACE-PCR扩增。
利用以下的程序进行降落PCR反应:
注意:
我们建议使用降落PCR反应,这就要求GSP的Tm值≥70度。
当循环结束时,利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl,使用适当的分子量marker。
可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带,在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2-5kb的时候,经常使用4min,0.2-2kb的时候将延伸时间减到2-3min,对于5-10kb的条带,延伸时间增加到10min。
RACE产物的验证:
应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员,验证是非常有用的。
有3种验证RACE产物的方法:
(1)比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
(2)Southern blot
(3)克隆并测序
我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。
比较由GSP和NGSP获得RACE产物
对于5‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
对于3‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
如果条带是正确的,在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE产物的克隆和测序:
可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物,此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点,将产物克隆到常规载体中.
对于5‘端的RACE产物,我们建议挑取至少8-10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。(反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端,尤其是长模板。另外,T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0-20个碱基。)
一旦鉴定了含有插入片断的克隆,应该获得多的序列信息。理想的是,可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。
全长cDNA的获得
通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后,可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR的方法获得全长cDNA:
扩增长的cDNA需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物。
根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端,应该是23-28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点,这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。
进行如下的热循环:
94度 30秒
25个循环 94度 5秒
72度 2-15分钟
延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如:预期得到6kb的条带,用6+2=8分钟的延伸时间。
注意:如果没有条带或者条带弱,增加5个循环;或者优化PCR的条件。
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的cDNA。
制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer,TBE的胶很难制备全长的cDNA。
将剩下的45μl反应物点样,选用适当的marker。
利用长波紫外观察cDNA(≥300nm)切下全长的cDNA。注意:应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克隆载体中。
Clontech的非常好, 感觉. 效果不好可能是RNA问题, 或RTase的问题. 因为目前clontech的RTase是Takara的产品,而非原来clontech的产品,可单购。