请问:有人用过takara的5‘race试剂盒吗?
2021-07-26
问题描述:
下一步我要做i5‘race,Invitrogen和clontech的kit太贵,takara的便宜,但不知用
takara的做得出来不,请各位高手指教,谢谢了!
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BM
用户
我也准备做,不过我师姐做了一次5‘race,可是没做出来,也不知是提的RNA的问题,还是试剂盒的问题,最近准备再重做一次。但是takara的3’RACE用过,效果不错。
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was1981
用户
5’的我用过,效果不错啊!但有以下几点要注意啊1、对所用的RNA的要求较高,尽量为新提取2、每次所得到的片段数目有限,说明书上为1000BP以下,但我所得到的一段为500,一段为300,所以长片段的可能要多次操作。3、每次都需合成带有磷酸化位点的反转录引物及四段特异性引物,所需代价较高,且操作尚有些复杂。但效果还不错啦 。
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lsqyao
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谢谢楼上的二位,再请教takara的5‘race里引物怎么设计?
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was1981
用户
1 、反转录引物设计时没有什么要点,5’端加一个磷酸化位点,长度12-15个,设计时尽量靠近5’末端的已知序列。2 、nestedPCR引物设计时同普通PCR引物设计,20mer左右,GC含量在50%左右,保证GC AT颁均匀,避免富有GC或AT,特别是3’端不要富含AT 引物设计用软件即可3 、在做1stPCR时,我一般选择较低的退火温度,电泳结果出现smear,在2ndPCR时,就会出现一条明亮的条带。
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