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RACE是什么牌子的? 电动工具 木工爱好者网木工网123
2021-07-27
RACE技术的简介
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
RACE的优点
与筛库法相比较,有许多方面的优点
1)此方法是通过PCR技术实现的,无须建立cDNA文库,可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2)节约了实验所花费的经费和时间。
3)只要引物设计正确,在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介
RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23-28个核苷酸序列信息,以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物(GSPs)。
RACE引物的设计:
基因特异性引物(GSPs)应该是:
23-28nt
50-70%GC
Tm值≥65度,Tm值≥70度可以获得好的结果
需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在,PCR的产物是特异性的。
反应中涉及到的一些事项
cDNA的合成起始于polyA RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA,背景会很高。
RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外,重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50-70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列,否则会产生回折和
如果要用重叠片段来检测设计的引物,GSp1和GSp2之间至少是100-200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中,退火温度高于AP1引物的Tm值,可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度,可以进行随后的PCR循环。
形成分子内氢键。另外,避免使用与AP1互补的引物,尤其是在3‘末端。
验证基因特异性引物的对照:
单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物,应该改变循环的参数,或重新设计原始引物。
利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达,利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段,应该重复cDNA的合成,或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
制备和抽提polyA RNA
不要使用DEPC处理过的水。
纯化完mRNA之后,利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5-12kb的拖带,在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。
具体的实验步骤
cDNA第一条链的合成:
我们建议进行cDNA合成的对照反应,这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后,在气浴中42度保温一个小时。
注意: 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积,从而降低第一链的合成效率。
将管放于冰上,以终止第一链的合成反应。
直接进行第二链的合成。
cDNA第二链的合成:
第二链合成的酶混合物中,含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照,试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。
建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5-3kb之间。
通过电泳检测cDNA的产量,与对照进行对比,这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。
接头的连接及连接产物的稀释
按照程序进行连接反应。
如果没有对比样品和对照的产量,利用Tricine-EDTA buffer制备接头连接的ds cDNA的1/50和1/250的稀释物,用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应,直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。
RACE-PCR扩增
进行5’和3’的RACE-PCR扩增。
利用以下的程序进行降落PCR反应:
注意:
我们建议使用降落PCR反应,这就要求GSP的Tm值≥70度。
当循环结束时,利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl,使用适当的分子量marker。
可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带,在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2-5kb的时候,经常使用4min,0.2-2kb的时候将延伸时间减到2-3min,对于5-10kb的条带,延伸时间增加到10min。
RACE产物的验证:
应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员,验证是非常有用的。
有3种验证RACE产物的方法:
(1)比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
(2)Southern blot
(3)克隆并测序
我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。
比较由GSP和NGSP获得RACE产物
对于5‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
对于3‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
如果条带是正确的,在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE产物的克隆和测序:
可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物,此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点,将产物克隆到常规载体中.
对于5‘端的RACE产物,我们建议挑取至少8-10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。(反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端,尤其是长模板。另外,T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0-20个碱基。)
一旦鉴定了含有插入片断的克隆,应该获得多的序列信息。理想的是,可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。
全长cDNA的获得
通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后,可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR的方法获得全长cDNA:
扩增长的cDNA需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物。
根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端,应该是23-28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点,这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。
进行如下的热循环:
94度 30秒
25个循环 94度 5秒
72度 2-15分钟
延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如:预期得到6kb的条带,用6+2=8分钟的延伸时间。
注意:如果没有条带或者条带弱,增加5个循环;或者优化PCR的条件。
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的cDNA。
制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer,TBE的胶很难制备全长的cDNA。
将剩下的45μl反应物点样,选用适当的marker。
利用长波紫外观察cDNA(≥300nm)切下全长的cDNA。注意:应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克隆载体中。
【求助】质粒小量抽提问题! 核酸基因技术讨论版论坛123
_迷糊司机
2017-10-01
我用Takara的小量
试剂盒
提质粒,但提出的量很少,导致酶切效果不好,加菌液的量1、1.5、3、4.5、6ml都试过了,都不行,加入SolutionII后不是特别透明,老是有点浑浊,打电话问客服,说是摇菌的问题,但我试过OD值小一些的菌液,也不行,希望能尽快找到原因,...
dawoo886的自频道优酷视频123
不二橙之
2017-10-01
刚开始做实验不太懂也没人可以咨询~~希望求个大神帮助我没多少分但是可以给适当的酬谢哈~~谢谢啦
clontech公司RACE试剂盒说明书123
mjd99sy
2010-07-19
我最近做race,用的是clonetechsmarterRACE
试剂盒
,但是再设计
引物
的时候,很难找到Tm》65,GC:50~70%的引物,一般来说Tm值可以通过增加引物长度得到满足,但是GC一般都很低都是40左右,这样的引物弄够做吗?
还有就是我准备做nestedPCR,试剂盒中提供了一个NUP(不知道试剂盒中提供的那个controlReagent序列是NUP的吗?),但是好像没有序列,那我在设计NGSP的时候不需要考虑试剂盒引物跟NGSP的二聚体或者二级结构吗?
谢谢~~
有人不用试剂盒做出5’RACE吗? 分子生物 综合其他 ...123
yushenghehe
2017-10-01
可以自己合UPM和NUP,只买phusion酶就行
英文表格race如何填写_123
2017-10-01
其实在西方国家(多人种国家)这项是不用填的,也很少有人要求你填,尤其是在应聘中(当然,在某些国家或地区,类似于政审之类的是例外),因为法律规定任何人都有平等就业的权利,所以如果资方要你填"种族"这项,就有种族歧视的嫌疑,资方就有被控的可能
请教大家做5'RACE都用的什么试剂盒 生物科学 论坛学术...123
嚣张的小宝H88e
2021-07-25
罗氏的不错,主要是SMAT技术
Clontech的非常好, 感觉. 效果不好可能是RNA问题, 或RTase的问题. 因为目前clontech的RTase是Takara的产品,而非原来clontech的产品,可单购。
【求助】Takara 3’race试剂盒中的反转录引物中的TaKaRa独特设计的...123
yjbgod
2009-06-20
反转录酶
和其他东西都可以单买就是
引物
不行,问各位大侠个问题是不是这个区域就是Oligodt18加OuterPCR引物的互补序列呢?自己
合成
可以么?效果如何,谢谢
RACE技术怎么理解?123
骚哥mFE06U
2021-07-28
RACE是获得cDNA的全长,而TAIL-PCR则是扩增已知片段的未知旁侧序列。前者用于获得全长cDNA,后者用于确定某一片段的位置,比如T-DNA插入突变体中T-DNA的插入位置。
generacer64 rlmrace kit多少钱 123
红妆对镜残323
2021-07-22
说明书应该很好懂啊,实在不行你给他们公司去邮件要中文说明书,一般是会给的
【求助】做RACE的困惑 核酸基因技术论坛123
wuyi3001
2007-11-14
请大虾们不吝赐教,小女子感激不尽!:I:I
【求助】RACE试剂盒哪个公司的比较好用? 核酸基因技术讨论版...123
chang810826
2007-04-17
我准备做3‘和5‘RACE,请问哪个公司的
试剂盒
比较好用?操作是不是完全按照说明书进行?请做过这方面试验的师哥、师姐们谈谈经验。小妹才疏学浅,请大家帮帮忙!
Klen Taq
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