Description: | Novel Coronavirus COVID-19 (2019-nCoV) Real Time RT-PCR Kit is used for the qualitative detection of a novel coronavirus, which was identified in 2019 at Wuhan City, Hubei Province, China, in upper respiratory tract specimens (nasopharyngeal extracts, deep cough sputum, etc.) and lower respiratory tract specimens (alveoli irrigation fluid, etc.) by real time PCR systems. |
Order #: | RR-0478-02-ZJ |
Unit Size: | 25 tests |
Supplier: | Liferiver Bio-Tech |
Restrictions: | Only available in selected countries. |
Shipping: | Dry Ice |
Storage: | -20 °C |
Subcategory: | Real Time PCR Diagnostic Kits |
More information: | Go to webpage |
MoBiTecGmbH是一家私人控股公司,由StephanDiekmann教授于1987年创立。与Max-Planck学会的密切关系以及德国领先的研究中心之一哥廷根的所在地促进了与某些研究中心的密切合作。德国最具创造力的科学家。此外,MoBiTec一直与欧洲和北美的科学家广泛合作,包括法国巴斯德研究所和荷兰Vrije大学的科学家。通过将许多研究人员的精彩创意商业化,MoBiTec能够提供一系列独特的高质量产品和简化的协议,使实验室生活更轻松,并为实际研究留出更多时间。MoBiTec的产品包括e。G。用于体内检测蛋白质-蛋白质或DNA-蛋白质相互作用的双杂交系统,用于筛选特定肽配体的噬菌粒展示系统和选择具有特异性结合特性的新蛋白质,方便的LamBDaPS基因组文库用于克隆的多功能DNA载体,表达和分析靶基因,有效表达和纯化重组蛋白的试剂盒,细胞转染试剂和细胞培养工具,固定化和可溶性酶,许多用于基因组学和蛋白质组学研究的产品(例如用于PCR,核酸和蛋白质纯化和分析),众多抗体,细胞因子,生长因子和重组蛋白,优质荧光试剂和试剂盒(如蛋白标记试剂盒,标记抗体,细胞染色试剂,柱和凝胶电泳附件)。与其自有产品线并行,MoBiTec分销德国多家国际公司的产品,包括荧光探针和研究化学品(AnaSpec,TEFLabs),量子点,各种DNA纯化试剂盒和DNA聚合酶(EdgeBio),诊断工具(ZJBioTech)),凝胶电泳配件(Amresco,ClareChemical),糖生物学产品(DextraLaboratories,Sumitomo),细胞转染试剂(Mirus)以及抗体,蛋白质,底物,精细化学品和分子和细胞生物学试剂盒 -特别是病毒学,免疫学,神经生物学,细胞凋亡,信号转导,细胞增殖,细胞毒性和癌症研究(MBLI,AGScientific,Amresco,AdarBiotech,AnaSpec,Echelon)。MoBiTec提供全面的服务,从清晰完整的产品文档开始,为客户提供个性化的建议和技术服务。MoBiTec产品通过MoBiTec的总部在德国分销,在其他国家由分销商分销。此外,MoBiTec不断寻求新产品和可销售的许可技术,因此对科学合作非常感兴趣,以开发创新的产品理念。
MoBiTec拥有来自欧洲和北美的研究人员,包括法国的Pasteur研究中心和荷兰的Vrije大学的科学家。MoBiTec公司能提供独一无二的高质量产品,从而简化实验设计,而留出更多更宝贵的时间用于实际的研究。产品包括:双杂交和单杂交系统——体内蛋白-蛋白和DNA-蛋白关系,噬菌体展示系统——筛选特殊的多肽配体和选择具有特异性结合特性的新的蛋白质,LamdaPS基因文库,用于克隆的多功能DNA载体,靶基因的表达与分析,重组蛋白质高效表达和纯化试剂盒,细胞转染试剂和细胞培养工具,各种固体和溶解状态的酶,基因组学和蛋白组学研究产品(PCR,核酸,蛋白质纯化分析),各种抗体、细胞因子、生长因子、重组蛋白质,高级荧光试剂和试剂盒(蛋白质标记试剂盒,标记抗体,细胞染色试剂,钙指示器),亲和层析仪,凝胶分析工具——凝胶柱和凝胶电泳附件。
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cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
RACE的优点
与筛库法相比较,有许多方面的优点
1)此方法是通过PCR技术实现的,无须建立cDNA文库,可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2)节约了实验所花费的经费和时间。
3)只要引物设计正确,在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介
RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23-28个核苷酸序列信息,以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物(GSPs)。
RACE引物的设计:
基因特异性引物(GSPs)应该是:
23-28nt
50-70%GC
Tm值≥65度,Tm值≥70度可以获得好的结果
需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在,PCR的产物是特异性的。
反应中涉及到的一些事项
cDNA的合成起始于polyA RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA,背景会很高。
RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外,重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50-70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列,否则会产生回折和
如果要用重叠片段来检测设计的引物,GSp1和GSp2之间至少是100-200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中,退火温度高于AP1引物的Tm值,可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度,可以进行随后的PCR循环。
形成分子内氢键。另外,避免使用与AP1互补的引物,尤其是在3‘末端。
验证基因特异性引物的对照:
单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物,应该改变循环的参数,或重新设计原始引物。
利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达,利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段,应该重复cDNA的合成,或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
制备和抽提polyA RNA
不要使用DEPC处理过的水。
纯化完mRNA之后,利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5-12kb的拖带,在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。
具体的实验步骤
cDNA第一条链的合成:
我们建议进行cDNA合成的对照反应,这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后,在气浴中42度保温一个小时。
注意: 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积,从而降低第一链的合成效率。
将管放于冰上,以终止第一链的合成反应。
直接进行第二链的合成。
cDNA第二链的合成:
第二链合成的酶混合物中,含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照,试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。
建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5-3kb之间。
通过电泳检测cDNA的产量,与对照进行对比,这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。
接头的连接及连接产物的稀释
按照程序进行连接反应。
如果没有对比样品和对照的产量,利用Tricine-EDTA buffer制备接头连接的ds cDNA的1/50和1/250的稀释物,用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应,直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。
RACE-PCR扩增
进行5’和3’的RACE-PCR扩增。
利用以下的程序进行降落PCR反应:
注意:
我们建议使用降落PCR反应,这就要求GSP的Tm值≥70度。
当循环结束时,利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl,使用适当的分子量marker。
可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带,在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2-5kb的时候,经常使用4min,0.2-2kb的时候将延伸时间减到2-3min,对于5-10kb的条带,延伸时间增加到10min。
RACE产物的验证:
应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员,验证是非常有用的。
有3种验证RACE产物的方法:
(1)比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
(2)Southern blot
(3)克隆并测序
我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。
比较由GSP和NGSP获得RACE产物
对于5‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
对于3‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
如果条带是正确的,在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE产物的克隆和测序:
可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物,此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点,将产物克隆到常规载体中.
对于5‘端的RACE产物,我们建议挑取至少8-10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。(反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端,尤其是长模板。另外,T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0-20个碱基。)
一旦鉴定了含有插入片断的克隆,应该获得多的序列信息。理想的是,可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。
全长cDNA的获得
通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后,可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR的方法获得全长cDNA:
扩增长的cDNA需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物。
根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端,应该是23-28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点,这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。
进行如下的热循环:
94度 30秒
25个循环 94度 5秒
72度 2-15分钟
延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如:预期得到6kb的条带,用6+2=8分钟的延伸时间。
注意:如果没有条带或者条带弱,增加5个循环;或者优化PCR的条件。
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的cDNA。
制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer,TBE的胶很难制备全长的cDNA。
将剩下的45μl反应物点样,选用适当的marker。
利用长波紫外观察cDNA(≥300nm)切下全长的cDNA。注意:应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克隆载体中。
RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段,通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法
RACE技术的原理和操作方法:http://wenku.baidu.com/link?url=J-9lPSGmRLQriSfXhOqcYYFvJx7ktGIRMgU6k9vDQIywtdJ8deNg7Qi5t4CgtjxuhWUBvQO6_qsULiqUIFckEZty75jYNw5yz6rNqiIKCwm
请具体点,把联系方式和价位都说一下好吗?
做一次5-RACE的话,克隆10个以上基因应该是可以的。本数据来源于百度地图,最终结果以百度地图最新数据为准。