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水中活细胞计数方法是:A计数法B平板法C染色涂片D平板菌落法新东方在线...
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陈文学邹学森陈岳青黄秀珍钟礼瀑(江西省肿瘤医院肿瘤研究所,江西南昌330029)[摘要]荧光定量PCR技术具有简便、灵敏、准确等优点,目前已经在乙肝和性病的诊断和治疗中得到了广泛的应用,但在肿瘤方面的应用还处在研究和开发阶段。本文综述近年国内外相关荧光定量PCR技术在肿瘤研究中的应用。[关键词]FQ-PCR;肿瘤;人乳头瘤病毒;EB病毒肿瘤是危害人类健康的一种疾病,它的恶性程度与预后判断主要依靠是否有转移和病理切片分期。随着分子生物学的迅猛发展,肿瘤研究领域的大量研究成果显示,肿瘤的发生、发展、治疗和预后与肿瘤细胞内部基因和肿瘤相关病毒有关。本文综述了荧光定量PCR技术的原理及其在肿瘤研究中的应用。1.单管荧光定量PCR技术的原理单管荧光定量PCR(fluorogenicquantitativePCR,FQPCR)的反应体系中除了普通PCR所需的引物外,还有一条荧光探针,探针的5`端标记了荧光报告基团,3`端标记了荧光淬灭基团,当这条探针保持完整时,荧光淬灭基团抑制荧光报告基团发出荧光。PCR反应开始后,随着DNA链的延伸,Taq酶的5`-3`外切酶活性将荧光探针切断,荧光淬灭基团的作用消失,荧光报告基团就发出了荧光信号,荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比,根据测量到的荧光信号强弱,通过分析软件得到样本的原始拷贝数。2.FQ—PCR的优点FQ—PCR技术是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点,实验的整个过程只在加样时打开1次反应管,在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化,根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量,因此也有人称FQ-PCR为实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR)。其优点为:①FQ-PCR解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题。②避免了普通定量PCR操作过程中的污染,FQ-PCR只在加样时打开反应管1次。③FQ-PCR操作简便、快捷、结果准确,不需要普通PCR扩增后进行电泳或放射自显影观察结果,方便了临床上应用。④FQ-PCR可以对每一批扩增样本进行扩增效率的评价。对DNA做系列稀释,每个稀释浓度的DNA对数值与其Ct值做回归分析,PCR的扩增效率的计算方法为:效率=10-1/斜率。通过计算扩增效率可以对仪器、操作人员和试剂进行综合评定。3.FQ-PCR在血液系统肿瘤中的应用JonesCD(1)对FQ-PCR技术预测慢性髓性白血病(CML)病人的髓外增的有效性进行了评价。FQ-PCR方法检测372例临床标本和50例外周血标本p210和p190bcr-ablRNA融合基因的转录水平,用看家基因对结果进行标准化,检测结果为特异性100%。敏感性研究显示,细胞系稀释到0.0001%时仍然可以检测到bcr-abl,重复性实验显示组间变异系数(CV)为12.3%,组内变异系数为13.8。实验结果显示FQ-PCR是一种非常可靠的监测bcr/abl阳性CML病人的方法。荧光原位杂交(FISH)的结果显示10%-15%的CML病人bcr-abl杂合子缺失,这样的病人预后非常差。FQ-PCR方法可以鉴定CML病人杂合子亚单位上的微小缺失,这种微小的缺失难于用FISH方法分辨出来。Kolomietz(2)用FQ-PCR方法对25例预后差的病人进行检测,18例无微小缺失CML病人获相对较好的治疗效果。Hughes等(3)将1106例CML病人随机分为imatinib(蛋白激酶抑制剂)治疗组和INF-a+卡铂治疗组,用FQ-PCR检测2个治疗组病人血液中bcr-abl的转录水平,结果显示imatinib治疗组12个月后bcr-abl的转录水平降低了3个数量级,治疗效果明显优于INF-a+卡铂治疗组。CML病人bcr/abl的转录水平降低了3个数量级或无转录者,预后较好。4.FQ-PCR在乳腺癌中的应用Weigelt等(4)用FQ-PCR方法检测94例乳腺癌转移的病人外周血CK19、p1B、PS2和EGP2的mRNA水平,通过QDA将4个基因综合成一个评价指标。在77例乳腺癌骨转移的病例中发现QDA阴性病人的存活率明显高于QDA阳性病人(P=0.015、0.0053),QDA阳性的病人1年存活率为3%,2年的总存活率为17%,而QDA阴性的病人存活率为36%。ANG1和ANG2是肿瘤细胞分泌的促进肿瘤细胞生长和转移的因子,Sfiligoi(5)研究了ANG与肿瘤细胞淋巴结转移和肿瘤病人的生存率之间的关系。38例乳腺癌活检标本提取mRNA,用FQ-PCR技术测定ANG1和ANG2基因水平,检测结果与临床病理和临床生化指标相比较,发现ANG2与腋窝淋巴结转移有高度的相关性,单变量和多变量生存分析显示,ANG2mRNA水平与疾病(p<0.0001)、总存活率(p<0.0003)呈单因素高度相关性。5.FQ-PCR在胃肠道肿瘤中的应用胃癌手术后的腹膜播散是胃癌复发的常见原因。Ueno(6)对124例胃癌手术病人实施腹腔灌洗,FQ-PCR技术检测灌洗液中CEA水平,结果显示CEA的Ct值与肿瘤的侵犯深度、淋巴结的转移、血管转移、肿瘤分期、存活率有高度的相关性。CEA的Ct值预测肿瘤腹膜转移的敏感性为76.9%,特异性为67.7%,而细胞学检测的敏感性只有23.1%。这些实验数据显示,FQ-PCR技术检测灌洗液中CEA水平,对预后和诊断是否有腹膜转移是一个很好的指标。alpha4GnT是一种糖苷转移酶,它只存在于胃癌细胞中,外周血中检测不到。Shimizu(7)对37例胃癌病人和23名健康人外周血alpha4GnT的mRNA进行荧光定量检测,胃癌病人的检出率为62.2%,而健康人未检测出阳性。令人振奋的是有5例早期胃癌病人,胃癌侵犯只局限在粘膜层,alpha4GnT的mRNA的检出率达到80%。慢性胃炎、胃幽门螺杆菌感染的良性病变的alpha4GnTmRNA水平明显低于胃癌病人。这些结果表明定量检测外周血中alpha4GnT的mRNA是对胃癌的一个很好的检测指标。肝癌的早期发现对肝癌的治疗和预后非常重要,Chuma(8)对7个早期肝癌结节和7个进展期肝癌结节的12600个基因进行了定量分析,发现95个基因可以区分早期肝癌和正常组织,92个基因可以区分早期肝癌和进展期肝癌,其中热休克蛋白70基因(HSP70)在早期肝癌结节中明显上调,与癌前病变组织、正常组织存在明显差异(p<0.001)。6.FQ-PCR在其它肿瘤中的应用Gelmini(9)用FQ-PCR方法检测43例前列腺癌和16例前列腺良性增生病人的活检组织PSA,前列腺癌病人的PSAmRNA水平变异非常大,平均2.5x107(2x104-2.1x108)/ml,而良性增生肿瘤组织的平均拷贝数为1.3x106/ml,前者的表达水平明显高于后者(p=0.006),但是前列腺癌组织的PSAmRNA水平与外周血中PSAmRNA水平无相关性。Straub(10)用高灵敏度的FQ-PCR方法检测了129例前列腺癌根治术前后和19例前列腺良性增生的血标本中PSAmRNA水平,发现血浆中的PSAmRNA水平可以反映外周血中前列腺癌细胞的数量,对病人早期治疗和手术后病情监测及预后有一定帮助。Survivin是一种凋亡抑制蛋白,在非小细胞肺癌(NSCLC)早期呈现过度表达。Falleni[11]对86例NSCLC病人(IAandIB)定量检测SurvivinmRNA水平,结果80例(96%)病人检测出SurvivinmRNA表达,明显高于正常肺组织(p=0.008),并且鳞状细胞癌的表达水平高于其它类型肿瘤(p=0.0022),FQ-PCR技术是对肺癌早期诊断的一种有效手段。最近又有文献报道将FQ-PCR技术应用到头颈肿瘤(12)、口腔肿瘤(13)、淋巴瘤[14]等肿瘤中,得到了较好的检测结果。7.肿瘤相关病毒的检测人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌的主要诱发因素,已经证实宫颈癌组织与正常组织的HPV早期基因(E7)的表达水平有显著差异,Lamarcq等(15)用FQ-PCR方法探讨宫颈脱落细胞E7基因的转录水平是否可以诊断早期宫颈癌,结果显示在高分化SIL中HPV16或HPV18的E7基因的检出率为47%,正常组织未检测到,两者存在显著差异(p<0.006),此项实验也证明E7基因可以作为宫颈癌早期筛查的指标。DongSM等[16]对175例宫颈浸润癌,57例宫颈原位癌,60例正常对照的血浆进行传统PCR方法与FQ-PCR方法扩增HPV基因进行比较,传统方法浸润性宫颈癌的检出率为6.9%,原位癌的检出率为1.8%,正常组织的检出率为1.7%,FQ-PCR方法对浸润性宫颈癌的平均拷贝数为11163拷贝/ml,原位癌的拷贝数为8拷贝/ml,正常组织拷贝数为0,FQ-PCR方法明显优于传统PCR方法。早期鼻咽癌可以通过放射治疗进行根治,中晚期鼻咽癌有较高的复发率。Dong(17)对170例没有转移的鼻咽癌实施统一的放射治疗方案,在治疗前和治疗后6-8周用FQ-PCR方法检测血浆中EB病毒的含量,治疗后EB病毒的含量与鼻咽癌的总存活率有高度相关性(p<0.001),对鼻咽癌复发的阳性和阴性预测值分别为87%和83%。鼻咽癌治疗后EB病毒的含量可以准确反映治疗后肿瘤的残余水平,与肿瘤病人的存活率有高度相关性。8.肿瘤多药耐药基因检测肿瘤的多药耐药基因的出现使许多肿瘤患者治疗失败,以往用流式细胞仪或者免疫组化的方法检测p糖蛋白(多药耐药蛋白)是否表达,或者用PCR的方法检测mRNA,这些方法都很难实现标准化的操作和统一判断标准。FQ-PCR方法可以实现标准化的操作,并且可以直接定量出多药耐药基因(MDR)的拷贝数。Burger等(18)对59例原发性乳腺癌,以化疗为系统治疗的病人,进行了BCRP、LRP、MRP1、MRP2和MDR1基因的mRNA定量测定,结果为对化疗中度反应的病人5种基因的mRNA水平明显低于对化疗没有反应的病人。其中MDR1基因高表达组的病例分期明显低于MDR1基因低表达组(p<0.005),而且预后差。其它4种基因也存在同样差异,但是没有明显的相关性。Tseng(19)对50对正常与头颈癌组织的MDR1mRAN研究中发现,27例T/N>1的标本中IV、III、II和I期的MDR1分布为59.3%、22.2%、14.8%和3.7%,MDR1水平与肿瘤标本的分期有高度相关性(P<0.01),FQ-PCR方法对MDR1基因的检测可以辅助病理分期,指导临床治疗。9.结语FQ-PCR是在临床上广泛应用的一种基因定量检测技术,它不但能够准确定量肿瘤相关基因的表达,还可以对外周血中肿瘤标志物进行准确定量,据此可以对肿瘤早期诊断与肿瘤分期、分型,以及实现对肿瘤转移的早期发现及预后判断。因此FQ-PCR技术在临床上将有更加广阔的应用前景。参考文献[1]JonesCD,YeungC,ZehnderJL,etal.Comprehensivevalidationofareal-timequantitativebcr-ablassayforclinicallaboratoryuse[J].AmJClinPathol,2003,120(1):42-8.[2]KolomietzE,MarranoP,YeeK,etal.QuantitativePCRidentifiesaminimaldeletedregionof120kbextendingfromthePhiladelphiachromosomeABLtranslocationbreakpointinchronicmyeloidleukemiawithpooroutcome[J].Leukemia,2003,17(7):1313-23.[3]HughesTP,KaedaJ,BranfordS,etal.FrequencyofmajormolecularresponsestoimatiniborinterferonalfapluscytarABIneinnewlydiagnosedchronic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