【CNS前沿文献追踪】– 电穿孔 + HDR + CRISPR Cas9用于基因编辑
【CNS前沿文献追踪】– 电穿孔 + HDR + CRISPR Cas9用于基因编辑
北京德泉发布时间：2018/07/23 16:41 点击: 加载中..![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/201a0dcf-f1ce-45c3-83b3-4ed98cca962f.jpg\" "\\"1.png\\"")
此次分享的是一种新的技术组合，将人们熟知的技术：电穿孔、同源介导修复、CRISPR Cas9放到一起编辑T细胞，具体如下：
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/7ffafb9a-d639-4d4c-95d1-52c7a7924162.jpg\" "\\"2.png\\"")
DNA链对于细胞是有毒性的，会降低细胞活力，不同类型的DNA链毒性不同：ssODN-寡聚脱氧核苷酸、RNP-CRISPR Cas9核糖核蛋白、Plasmid-质粒、dsDNA-线性双链DNA
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/23a0809c-28e2-4a5e-8cf7-3334736279b4.jpg\" "\\"3.png\\"")
作者的策略是在要导入的序列两端加入与整合位点同源的序列，利用细胞自带的同源介导修复机制（HDR-用于修复细胞内偶发的DNA损伤）将新片段定点整合到基因组中以降低毒性
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/d5970e12-1051-47a7-870b-5598288b1e43.jpg\" "\\"4.png\\"")
RNP + dsDNA HDR + 电穿孔的方法能够高效、安全的把GFP序列导入并表达
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/daa3b32e-42c8-4b9c-a122-4c8ef7c0e66f.jpg\" "\\"5.png\\"")
验证通用性：新方法能有效用于各种类型的样品
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/77201e22-21b8-4c12-9000-3bfcbbb48c98.jpg\" "\\"6.png\\"")
验证通用性：设置不同的位点，导入GFP，细胞层面没问题，可以表达GFP
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/3f7af961-feb7-42e8-a24d-3df40c516d3b.jpg\" "\\"7.png\\"")
验证通用性：设置不同的位点，导入GFP，不同位点对应的亚细胞定位不同，显微镜空间角度验证-GFP的表达位置和靶序列对应蛋白亚细胞定位一致
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/0f8bb7de-17cb-422f-b2a9-660badd25a4d.jpg\" "\\"8.png\\"")
BATF是个转录因子，会结合到特定的DNA位点，CUT＆RUN法（类似CHIP的方法）验证GFP和BATF一起定位到了BATF结合的DNA位点，暗示新方法准确的将GFP基因整合到了BATP基因
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/c84515f6-0ced-40ba-af5e-ed1ab1b0d80e.jpg\" "\\"9.png\\"")
选取匹配的同源序列，如上图，用CD4同源序列新方法可以\"靶向”编辑混合细胞中的特定细胞亚群CD4 T细胞，不影响CD8 T细胞（RAB11A两种细胞都表达，用它的同源序列转CD4和CD8都会表达GFP）
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/cfd67e5f-daf5-4503-a1c1-2b3093ff75b2.jpg\" "\\"10.png\\"")
可将两个不同基因同时导入一个位点
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/86ca060b-d6cc-4c77-aa51-ea1a11a99a00.jpg\" "\\"11.png\\"")
可将两个不同基因同时导入同一个细胞的不同位点
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/fe3b5d26-f17b-400a-9647-ecb4f45aca99.jpg\" "\\"12.png\\"")
可将3个不同基因同时导入同一个细胞的不同位点
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/8718aa57-a206-46cc-99af-14a82100cab6.jpg\" "\\"13.png\\"")
前面只是单方面的看到了可把目的序列靶向整合，但是否存在脱靶不知道，用targeted locus amplification (TLA) sequencing看是否会脱靶-无脱靶
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/1c9d00df-219a-4888-9334-dac3abc7231a.jpg\" "\\"14.png\\"")
RNP（CRISPR Cas9）的作用是切开靶序列，做了\"脱靶”的RNP，发现即便切开了错误的位点，但由于同源介导修复模板（HDRT）的存在也不会发生脱靶
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/1d47964a-82fb-4b62-a77f-cfc8194623a8.jpg\" "\\"15.png\\"")
前面是以GFP为模型从各个角度证明方法的有效性，可用于编辑基因，开始在别的模型上看该方法用用于治疗疾病的可能：关注IL2受体突变，这个突变会造成IL2受体表达降低，IL2功能受限
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/b3de4f41-6044-4499-8c0c-48e41a9175cd.jpg\" "\\"16.png\\"")
设计HDR
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/63458b53-6f88-4311-ac99-2604f3d8c5c2.jpg\" "\\"17.png\\"")
能够校正IL2受体表达缺陷
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/719691c7-256e-40de-aac5-22ebb3c56b03.jpg\" "\\"18.png\\"")
校正IL2受体后，IL2信号得到恢复
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/1e005b4e-9df0-4f6f-8362-3ff9b67a3eec.jpg\" "\\"19.png\\"")
换一个模型看该方法的能用于治疗：让T细胞表达识别特异抗原的TCR
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/c5cc1ccc-dcc1-43a1-ade0-d989f56e1062.jpg\" "\\"20.png\\"")
In vitro，编辑出的TCR-T能够响应肿瘤细胞刺激分泌细胞因子、杀死肿瘤细胞
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/a9c758d2-8503-427f-8f2b-e0ff9d7dc8ec.jpg\" "\\"21.png\\"")
In vivo，编辑出的TCR-T能够抑制肿瘤生长
没有什么新的点，只是把旧有技术做了一个组合（同源介导修复、CRISPR Cas9、电穿孔），但故事讲的好 - 以病毒介导整合的随机性、DNA的\"毒性”为起点，接着多个角度证明方法的有效性，最后将方法和实际结合，落脚在当下的热点肿瘤免疫！技术和发现就在那里，决定高度的是你能看多远......
Theodore L. Roth, Cristina Puig-Saus, Ruby Yu, Eric Shifrut, Alexander Marson et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.[J] .Nature, 2018.
想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！
您认为该新闻：
![\"值得推荐\"](\"https://simg.instrument.com.cn/news/20130315/images/reco2.gif\")
0 次- 上一篇:毕导文章里面的Biotage
- 下一篇:视频中心 | Unicorn™ 7 中层析图峰面积的计算
- ·CNS前沿文献追踪–呼吸道合胞病毒RSV进入细胞新机制
- ·CNS前沿文献追踪 – CO位置影响减数分裂过程中染色体分离
- ·CNS前沿文献追踪-SPO16调节减数分裂的机制
- ·CNS前沿文献追踪 – Ded1p通过相变调节细胞翻译状态
- ·应用专题丨利用CTX质构仪评估包装袋的密封强度
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/202004/pic/6f71f7f2-c290-486d-bed0-99f87fe0afaa.jpg!w130x100.jpg\")
Diagenode全自动核酸剪切仪Megaruptor ®3
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/202003/pic/079eefef-74c3-40a6-8171-17ef77e3548a.jpg!w130x100.jpg\")
AMERSHAmersham ImageQuant 800 化学发光成像仪
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/202003/pic/eef5f592-38c6-4f6e-8f2a-c833730523f1.jpg!w130x100.jpg\")
比利时Diagenode BIORUPTOR超声波细胞破碎仪new pico
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/202003/pic/f448c760-550a-4eea-8fe4-5cbe3265f0f6.jpg!w130x100.jpg\")
Brookfield美国博勒飞-DVNext粘度计
![](\"https://img1.17img.cn/17img/images/202003/pic/86dfce08-97d7-45ea-afbd-46ccfcc36f29.jpg!w130x100.jpg\")
Brookfield美国博勒飞-KU-3 粘度计
本文链接： https://www.ebiomall.cn/b115-diagenode/info-1532335263.html
