发表于 12 2022 年 4 月

由 InVitria 细胞培养总监 Sofia Pezoa 博士撰写

Sofia Pezoa 是 InVitria 细胞培养团队的负责人，她致力于病毒制造的产品开发用于基因治疗和疫苗的载体。在加入 InVitria 之前，Sofia 在科罗拉多安舒茨大学获得细胞生物学、干细胞和发育生物学研究生课程的博士学位。

FBS 的大规模应用由于潜在的外来因子污染、全球供应有限导致供应链不可靠，以及由于批次 t 导致的载体产量的相当大的可变性，临床制造应用存在重大风险o 批次成分变化。为了规避与在贴壁细胞的病毒载体生产培养基中使用血清相关的许多挑战和缺点，我们利用重组人蛋白质来配制化学成分确定的、无血清和无动物成分的培养基，该培养基专门针对 293 中病毒载体的生产进行了优化和 293T 细胞在 iCELLis 固定床生物反应器中，称为 OptiPEAK HEK293t®。因此，我们在 OptiPEAK HEK293t 中进行了优化研究，以确定 iCELLis Nano 生物反应器中 LV 生产的最佳参数。测试的参数包括转染时的细胞密度、转染后的线速度、pH 值以及转染后的溶解氧 (DO)。我们的结果表明，转染时的高细胞密度与病毒滴度呈负相关。我们还观察到，在不影响病毒滴度的情况下，可以在转染后使用高线性进料速率。综上所述，我们有 demonstrated，iCELLis Nano Bioreactor 可与 ACF 条件一起使用，以实现用于临床制造的高慢病毒滴度。

利用病毒载体治疗罕见疾病或产生用于癌症治疗的修饰 T 细胞的临床疗法是一种有前途的治疗方法，临床成功率不断提高。具有贴壁 HEK293 或 HEK293T 细胞的病毒载体的制造通常包括补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 的基础培养基，用于病毒载体的生长和生产。虽然包含 FBS 支持生长和载体生产，但围绕 FBS 的使用仍然存在相当大的安全问题，以及对在大规模生产中使用 FBS 的担忧。此外，证明最终载体产品中已去除 FBS 的要求可能会阻碍临床试验的进展。尽管围绕 FBS 存在安全问题，但关于贴壁 HEK 细胞的制造能力的数据有限使用完全不含血清或动物来源成分的培养基。尽管 FBS 的化学成分不确定并且含有未知水平的生长因子或蛋白质，但已确定 FBS 中的几种成分对细胞生长和附着至关重要。因此，我们利用重组人蛋白来配制一种化学成分确定、无动物成分 (ACF) 的培养基，该培养基支持贴壁 HEK 细胞生长和病毒载体生产，称为 OptiPEAK HEK293t®。

我们之前的结果表明，OptiPEAK HEK293t在餐具中产生高滴度慢病毒。为了证明 OptiPEAK HEK293t 可用于临床制造，我们将我们的餐具工艺扩展到 iCELLis Nano 生物反应器。 iCELLis 生物反应器技术支持 HEK 贴壁载体生产，并可通过 iCELLis 500 扩展到大规模格式。尽管该技术可扩展用于临床制造，但病毒载体生产的设定点参数尚未得到强化仔细调查。此外，据报道，iCELLis 生物反应器中的慢病毒产量明显低于扁平器皿中的滴度，这表明生物反应器不支持慢病毒生产，或者设定点参数对于慢病毒生产而言不是最佳的。因此，我们假设可以在 iCELLis 生物反应器中优化设定点参数以获得高效价慢病毒。我们在 iCELLis 生物反应器中使用 OptiPEAK HEK293t 并优化转染密度、线速度、pH 和溶解氧 (DO) 以实现高慢病毒滴度。我们的结果表明，无血清、ACF 工艺可以纳入病毒载体临床生产的制造方法。

细胞系和培养方法

HEK293T 和 HT-1080（ATCC目录 CRL-3216 和 CCL-121) 保存在含有 GlutaMAX（Gibco，纽约格兰德岛）的高葡萄糖 DMEM 中，辅以 10% 美国来源的胎牛血清（Gibco，格兰德岛，纽约），用于 HT1080 或用于 HEK293T 的 OptiPEAK HEK293t（InVitria，Junction City，KS）。 OptiPEAK HEK293t 培养细胞在 CellBIND® 烧瓶（产品目录 #3290，Corning，Corning，NY）上保持在 10% CO2 和 95% 湿度的环境中。通过每周传代两次并以每平方厘米 10,000 个细胞的密度接种来维持细胞。使用血细胞计数器通过台盼蓝排除法测定细胞密度和活力。

用于慢病毒生产的 iCELLis 固定床生物反应器运行

iCELLis 生物反应器（0.53m2，Pall Corporation，Westborough MA）配备生物质探针（Aber，Arlington VA）以及 DO 和 pH 探针根据制造商的说明进行组装和校准。生物量探针被设置为每 40 毫秒读取以 pF/cm 为单位的电容，并且使用细胞密度（细胞/cm2）= 928.47 * 电容的等式将所得电容与细胞密度相关联。该等式是通过非病毒细胞核计数与电容之间相关性的线性回归确定的生产生物反应器运行（Laskowski 等人，2019 年）。生物反应器通过高压灭菌器灭菌，然后用 650 mL OptiPEAK HEK293t 进行批处理，除非另有说明，否则在细胞接种前 24 小时确保细胞附着表面完全润湿和生物质探针电导率正常化。在接种之前，生物量探针被设置为零，细胞接种被认为是时间 = 0 (T0)。通过 BioXpert SCADA 软件在线监测生物反应器参数，每天一次从生物反应器中收集用过的培养基，以测量培养基代谢物和离线 pH 值。除非另有说明，转染前的生物反应器设定点保持在 37°C、pH 7.25、线速度 2 cm/s 和 95% D2O 或 55% D2O 用于血清条件。通过用补充有 1 mg/mL 重组转铁蛋白（Optiferrin，InVitria，Junction City，Kansas）的 OptiPEAK HEK293t 转染，用 LV 载体质粒转染生物反应器。工作量的10%me用于复合，然后通过完全培养基交换将650mL包括转染复合物的转染培养基添加到生物反应器中。转染生物反应器 2 小时，同时保持生物反应器设定点。转染后，生物反应器进行完全培养基更换，变成完全生长培养基，生物反应器再运行 72 小时。从生物反应器中收集完整的上清液收获 LV 载体，通过离心澄清，并立即用于功能滴定。

功能滴定

HT-1080 细胞接种在 12 孔板中以 30,000 个细胞/孔铺板，并允许在正常生长条件下粘附 2 小时。对于 GFP 转导，Lenti-pSIH1-H1-siLuc-copGFP 在由 DMEM+10% FBS 组成的感染培养基中滴定。使用 Lenti-pSIH1-H1-siLuc-copGFP 的转导是在 10 µg/mL 聚凝胺（Millipore Sigma，St. Louis，MO）存在的情况下完成的。慢病毒载体滴度为 p以前描述过（Sena-Esteves & Gao，2018）。在继代培养结束时，用 1x TrypLE + 1 mM EDTA 收获细胞，并用 DPBS 中的 10% FBS（ThermoFisher Cat. #1404141）淬灭酶。将细胞沉淀并重悬于辅以 10% FBS 和 1x F-68（ThermoFisher，目录号 #24040032）的 DPBS 中。 GFP表达通过流式细胞术测定。

共运行了 11 个 iCELLis Nano 生物反应器以确定 ACF 中高滴度慢病毒生产的最佳条件中等（总结于表 1）。我们最初假设高转染密度会在转染后产生更多的病毒产生细胞。因此，iCELLis 生物反应器以 10,000 个细胞/cm2 的细胞密度接种，并在接种后 3 天进行转染。转染当天，细胞密度大于170,000个细胞/cm2。递送的质粒DNA的量也增加以解释增加的生物量。产生的慢病毒的功能滴度非常低，功能滴度为 2e+5 TU/mL 或更低（表 1）。因此，与几乎高出三倍的 DNA 浓度相比，我们用每 cm2 递送的 DNA 量较少的情况重复了该实验，以确定大量 DNA 或 PEI 是否具有细胞毒性。 DNA 以 0.16 µg/cm2 或 0.44 µg/cm2 的浓度输送，同时将细胞密度保持在大约 170,000 个细胞/cm2。与第一个实验相比，最低 DNA 量产生了适度的改进；然而，功能吨iter 仍然很低，约为 1.07e+6 TU/mL（表 1）。在线生物量探针测定的较高 DNA 浓度未观察到生存力下降；因此我们得出结论，高细胞密度通过接触抑制或细胞聚集抑制了转染效率。我们用比前两个实验低三倍的靶转染细胞密度进行了进一步的优化研究，并解决了线速度、DO 和 pH 等转染后参数，同时将转染时的靶细胞密度保持在 50,000 和 100,000 之间细胞/cm2（运行 6-11）。转染后的总生产时间为 72 小时，病毒生产在没有灌注的情况下运行。

然后通过 Spearman 相关分析转染后 72 小时大量收获的功能滴度，以确定转染后设定点参数与慢病毒滴度之间是否存在任何相关性（图 1）。转染密度（细胞/cm2）、转染 DNA 浓度和 DO 均与病毒滴度呈强烈负相关，表明转染时细胞/cm2 密度较高或为转染递送的大量 DNA 会对病毒产生负面影响滴度可能通过低转染效率（图 1）。DO 也呈负相关，表明细胞不会消耗大量病毒生产过程中的氧气量。大于 7.1 的 pH 值与滴度呈强烈负相关，在 pH 值小于 7.0 时可获得高滴度，这与之前观察到的低 pH 值有助于稳定慢病毒膜一致（Holic 等人，2014）。在测试的不同转染后参数中，2 cm/s 的较高线速度与病毒滴度呈正相关。该数据表明，VSV-G 假型慢病毒对 iCELLis Nano 中的剪切应力不敏感，或者与 1 或更低的线速度相比，通过固定床的更高进料速率通过增加营养分布来提高病毒产量。

慢病毒生产的最终评估包括比较 iCELLis Nano 生物反应器中的病毒生产与使用 OptiPEAK HEK293t 或含有 10% FBS 的 DMEM 分批的 iCELLis 生物反应器。两个 0.53m2 iCELLis Nano 生物反应器接种了在 OptiPEAK 中连续传代的 HEK293T HEK293t 或 DMEM + 10% FBS。

两种 iCELLis 生物反应器均以 10,000 个细胞/cm2 接种，并在接种后第 2 天进行转染。最初在餐具中进行的实验表明，HEK293T 在 DMEM + 10% FBS 和用相同的 DNA 转染，并且从 iCELLis Nano 优化中优化的转染密度在OptiPEAK HEK293t 中产生的慢病毒的标准偏差。因此，我们将针对慢病毒优化的相同转染参数和转染后设定点应用于 iCELLis Nano，以使用 OptiPEAK HEK293t 和 DMEM + 10% FBS 培养基生产慢病毒。在转染后 48 小时和 72 小时收集来自生物反应器的总上清液，澄清，然后立即用于功能滴度。在慢病毒生产过程中，两种培养基的葡萄糖消耗具有相似的趋势，尽管 DMEM 最初以较高的葡萄糖水平开始，因为培养基被配制成高葡萄糖（图 2，A）。乳酸趋势也相似，DMEM + 10% FBS 由于 FBS 中存在乳酸，因此起始乳酸水平较高（图 2，B）。虽然高浓度的乳酸可能对细胞有毒，但较低水平的初始乳酸暴露没有任何已知影响。 iCELLis 生物反应器中两种培养基的生长趋势也非常相似（图 2，C)。在转染时，两种生物反应器的细胞密度（细胞/cm2）约为 80,000 个细胞/cm2，这表明对于两种培养基，细胞每个细胞将接收相同的质粒 DNA。尽管生长动力学和转染密度相同，但在转染后 72 小时，使用 DMEM + 10% FBS 的 iCELLis 生物反应器的功能滴度在生产结束时产生了 2.6e+6 TU/mL 的中等滴度（图 2，D）。 OptiPEAK HEK293t 生产结束时的最终功能滴度为 1.07e+7 TU/mL，比使用 DMEM + 10% FBS 产生的滴度高约三倍。总而言之，使用 OptiPEAK HEK293t 实现的高滴度还表明慢病毒在 iCELLis nano 中对剪切不敏感，并且增加的线速度提高了产量。

我们这里的结果表明可以使用 HEK293T 生产慢病毒在不含血清或动物来源成分的培养基中。为了证明慢病毒可以生产由于 iCELLis 生物反应器技术可通过 iCELLis 500 扩展到大规模生产，因此我们使用代表大规模生产的形式进行了慢病毒生产，我们在 iCELLis Nano 生物反应器中进行了慢病毒生产。我们的结果表明可以优化设定点参数以实现高滴度慢病毒，转染密度和转染后 pH 值是使用 ACF 培养基 OptiPEAK HEK293t 实现高滴度的两个最关键点。目前尚不清楚为什么 DMEM + 10% FBS 在 iCELLis Nano 中没有产生高滴度。虽然我们的工艺针对 OptiPEAK HEK293t 进行了优化，但在餐具条件下，我们取得了与 DMEM + 10% FBS 和 OptiPEAK HEK293t 相当的结果。增加的蛋白质含量或不确定的胆固醇水平是否会对 iCELLis 生物反应器中的病毒滴度产生负面影响还有待测试，此外，其他人已经报道了不同批次的 FBS 的可变滴度。因此，OptiPEAK HEK293t 可用于克服批次间差异y 用 FBS 观察。总的来说，我们已经证明 OptiPEAK HEK293t 无血清 ACF 培养基可以很容易地用于生产高滴度慢病毒。

参考

Junction City, KS 66441电话：1.800.916.8311

电子邮件：Info@InVitria.com

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