主页在造血干细胞扩增中使用重组转铁蛋白应用说明在造血干细胞扩增中使用重组转铁蛋白应用说明

2019 年 5 月 29 日发布

Marcus Curl，产品应用科学家， InVitria

越来越多的临床案例有力地证明了造血干细胞 (HSC) 疗法是治疗血癌和许多其他曾被认为无法治愈的衰弱性疾病的潜在疗法 [1] .实现这些疗法开发的一个关键工具是体外扩增 HSC [2]。然而，在 HSC 生长培养基中补充血清来源的培养基补充剂（例如无异源培养基和其他动物来源成分中的那些）可能会引入外来病原体，在细胞扩增过程扩大生产规模时产生变异性，并且还会呈现临床公关供应链中断的风险...无法治愈[1]。实现这些疗法开发的一个关键工具是体外扩增 HSC [2]。然而，在 HSC 生长培养基中补充血清来源的培养基补充剂（例如无异源培养基和其他动物来源成分中的那些）可能会引入外来病原体，在细胞扩增过程扩大生产规模时产生变异性，并且还会呈现临床产品制造供应链中断的风险。

使用严格化学成分确定的培养基，辅以血清或动物源性成分的替代品，已多次被确定为减少变异、提高一致性、并实现可扩展性用于细胞疗法 [3,4]。随着使用化学成分确定的培养基配方的趋势增加，一个重要的考虑因素是需要实现有效的细胞内铁输送。铁是细胞代谢、细胞复制和其他特殊功能的重要方面 [5]。然而，尽管铁在细胞生物学中起着核心作用，但游离的亚铁 (Fe2+) 在溶液中很容易氧化成三价铁形式 (Fe3+)。三价铁是活性氧和自由基形成的催化剂，这些活性氧和自由基对活体动物和细胞培养系统具有毒性 [5,6]。

转铁蛋白是铁结合糖蛋白，由肝脏，天然存在于血清中。如图 1 所示，它们的功能是回收铁以维持基本的细胞过程，同时抑制有害分子的机会性形成。转铁蛋白通过与细胞外游离三价铁原子结合来控制体内循环铁的游离水平并通过内吞作用将它们输送到细胞中 [7]。一旦转铁蛋白将其铁有效载荷输送到细胞内，它就会作为无铁转铁蛋白再循环，并可用于在催化循环中结合额外的铁。这个循环在快速分裂的细胞中每 15 分钟发生一次。

图1 人血清转铁蛋白内化机制

通过螯合铁，转铁蛋白使其可用于细胞功能，同时显着降低循环游离铁催化有毒自由基分子形成的能力 [6]。在细胞培养中，转铁蛋白通常作为胎牛血清的成分提供；然而，化学成分确定的培养基需要这种必需成分的纯化重组形式，因为它们不含血清。

Optiferrin 是一种重组且完全不含动物形式的人转铁蛋白，由 InVitria 使用非哺乳动物宿主大规模生产。因此，它是用于 HSC 扩增和其他敏感干细胞应用的化学成分确定培养基补充转铁蛋白的最佳来源。 Optiferrin 用作体外细胞培养的铁伴侣。该产品是一种必不可少的工具，可用于开发更稳健、性能最佳的化学成分确定的培养基，且没有铁催化自由基形成、氧化反应、外来病原体或动物或血清来源污染物的风险。

所需材料：Optiferrin ReconstitutionOptiferrin（InVitria 产品编号：777TRF029）选择的基础培养基或磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 分析天平无菌容器 – PETG 诊断瓶：无菌（Fischer Scientific #02-925-104）原液过滤 PES 低蛋白结合膜过滤器, 0.2 微米，30 毫米（Celltreat #229747）注射器：Sterile Luer-Lock 注射器，3 mL (Medline #SYR103010H)方案：200mg/ml 储备液制备对于 5 至 10 ml 最终体积的 200mg/ml 储备液，称取 1 至 2g Optiferrin 放入无菌容器中，使用分析计算重构volume 使用以下等式：

Optiferrin 方程 1

缓慢加入最终体积的 70% 的 PBS 或基础培养基，注意防止产生 将瓶子放入 2 至 8 °C 的水浴中，直到所有蛋白质都溶解后测量新的体积，然后加入PBS 或基础培养基的剩余体积等于计算的重悬用吸管轻轻上下以确保均匀的储备溶液过滤在无菌层流罩中，将重构的 Optiferrin 储备溶液倒入无菌的 Luer 锁头连接一个 0.2 微米的 PES 过滤器。将溶液过滤到一个新的无菌容器中补充水平测定和添加到细胞培养基中通过滴定储备溶液实验确定 Optiferrin 补充的最佳浓度范围。根据确定的细胞特异性补充水平，将相应体积的 200mg/ml 原液添加到生长培养基中。

Optiferrin Equation 2

对于 HSC，对于 50mg/L 的理论补充水平，添加 0.25ml 的 200mg/L ml Optiferrin 原液加入 1L 培养基中，在培养基配方中产生 50mg/L 的终浓度。

结果与讨论：

如图 2 所示，铁载体和铁螯合剂补充剂的存在影响扩散r人类 HSC 的 ates。与缺乏铁螯合剂或铁载体的培养条件相比，补充这些成分可为人类 HSC 的增殖提供显着益处。在 6 天的扩展期内，重组人转铁蛋白 Optiferrin 的性能比从血清中提取的人转铁蛋白高出近三倍，并且与铁螯合剂相比也具有更优越的性能。这些结果支持使用 Optiferrin 作为补充剂来改善人类 HSC 在需要化学成分确定的培养基的应用中的增殖。

图2 CD34+干细胞（HSC）从人脐带单核细胞中分离出的血液在培养中扩增 6 天。在基础培养基和 1g/L Cellastim S 重组人白蛋白中，不同的铁源和铁载体以 50mg/L 的浓度补充 er。与不包含任何铁载体或其他铁源的条件相比，可以观察到补充对增殖的相对影响。使用血浆人血清白蛋白和铁螯合物（血浆 HSA/铁螯合物 = 标准化为 100）对细胞计数进行标准化。在此处查看 PDF 脚注 Trounson A、Thakar RG、Lomax G、Gibbons D。干细胞疗法的临床试验。 BMC 医学。 2011；9：52。 https://doi.org/10.1186/1741-7015-9-52Park B、Yoo KH、Kim C. 造血干细胞扩增和生成：取得突破的途径。血库2015;50(4):194-203。 https://doi.org/10.5045/br.2015.50.4.194Chisini LA、Conde MCM、Grazioli G 等。静脉血衍生物作为间充质干细胞的 FBS 替代品：系统范围界定审查。 Braz Dent J. 2017；28(6)：657-668。 https://doi.org/10.1590/0103-6440201701646van der Valk J、Brunner D、De Smet K 等。化学成分确定的细胞培养基的优化-repla在哺乳动物体外方法中提取胎牛血清。体外毒理学。 2010；24（4）：1053-1063。 https://doi.org/10.1016/j.tiv.2010.03.016Wang J, Pantopoulos K. 细胞铁代谢的调节。生物化学杂志 2011；434(3)：365-381。 https://doi.org/10.1042/BJ20101825Baldwin DA、Jenny ER、Aisen P. 人血清转铁蛋白和牛奶乳铁蛋白对超氧化物和过氧化氢形成羟基自由基的影响。 J 生物化学。 1984;259(21):13391-13394.Luck AN, Mason AB。转铁蛋白介导的细胞铁输送。 Curr Top 成员2012；69：3-35。 https://doi.org/10.1016/B978-0-12-394390-3.00001-X开始新搜索快速搜索链接应用：

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