肿瘤干细胞培养液可以加双抗么？

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肿瘤干细胞培养液可以加双抗么？

2017-07-02

问题描述：

如题，想直接从原代肿瘤细胞中筛选干细胞，用的无血清未加双抗的培养基，做了三次，都污染了，都是第二天去看培养基就黄掉了，以前做过肿瘤细胞，都没有这种情况，肿瘤细胞培养液有加双抗，因此想问下干细胞培养液可以加双抗么？以及有没有小伙伴做过直接培养原代肿瘤干细胞的，指导指导哇。

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医心如泉

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展开引用dxy_h2lc4whq 如题，想直接从原代肿瘤细胞中筛选干细胞，用的无血清未加双抗的培养基，做了三次，都污染了，都是第二天去看培养基就黄掉了，以前做过肿瘤细胞，都没有这种情况，肿瘤细胞培养液有加双抗，因此想问下干细胞培养液可以加双抗么？以及有没有小伙伴做过直接培养原代肿瘤干细胞的，指导指导哇。......可以的吧，做原代时，我PBS里都加双抗了

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七更七子石

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可以加，但是尽量还是不要加吧。要看你的细胞来源，还有培养基是不是已经不行了，或是培养环境。当然，加双抗是最保险的，但是也不能完全避免。是什么污染清楚么

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dxy_h2lc4whq

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七更七子石可以加，但是尽量还是不要加吧。要看你的细胞来源，还有培养基是不是已经不行了，或是培养环境。当然，加双抗是最保险的，但是也不能完全避免。是什么污染清楚么我的是结肠肿瘤组织，上两次都是培养基很快就变黄了，应该是细菌污染，这次用了加双抗的培养基，早上去看的时候培养基颜色正常，打算养一段时间后就把双抗去掉。能不加还是不加好。对了，我用胶原酶处理的原代肿瘤细胞，需要直接筛选肿瘤干细胞，即使过滤了也还是有细胞团或组织团，肉眼已经看不见了，显微镜下可观察，请问如何去除它们，你有没有什么好的方法，求赐教。

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dxy_h2lc4whq

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医心如泉可以的吧，做原代时，我PBS里都加双抗了谢谢，请问您做的是什么原代？

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Ucell

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可以加的

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医心如泉

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dxy_h2lc4whq谢谢，请问您做的是什么原代？小鼠骨髓脾脏做免疫细胞

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七更七子石

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展开引用dxy_h2lc4whq我的是结肠肿瘤组织，上两次都是培养基很快就变黄了，应该是细菌污染，这次用了加双抗的培养基，早上去看的时候培养基颜色正常，打算养一段时间后就把双抗去掉。能不加还是不加好。对了，我用胶原酶处理的原代肿瘤细胞，需要直接筛选肿瘤干细胞，即使过滤了也还是有细胞团或组织团，肉眼已经看不见了，显微镜下可观察，请问如何去除它们，你有没有什么好的方法，求赐教。......结肠癌之前我也做过，这个是重度污染的，我都是用高浓度P/S去清洗的，培养的时候必须加双抗。当然，如果不想用抗体的话可以通过流式sorting，也可以用生物净化。流式比较快，而且挺方便的，生物净化周期比较长，成功率还不太高。

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dxy_h2lc4whq

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七更七子石结肠癌之前我也做过，这个是重度污染的，我都是用高浓度P/S去清洗的，培养的时候必须加双抗。当然，如果不想用抗体的话可以通过流式sorting，也可以用生物净化。流式比较快，而且挺方便的，生物净化周期比较长，成功率还不太高。可是过流式得把细胞消化成单个细胞，可我目前的酶不能完全把组织消化成单个细胞，这样会堵流式得柱子。请问您是怎么克服的呢？还有能不能把您当初做结肠癌的过程发我下，我想看看是哪一步污染了，昨天做的今晚去看又黄了，还有您去医院取组织是怎么取的。我感觉总这个方法污染太大了。组织在外爆率时间太长了。

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dxy_h2lc4whq

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医心如泉小鼠骨髓脾脏做免疫细胞有么有做过人的啊？我的最近老污染，心累

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医心如泉

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dxy_h2lc4whq有么有做过人的啊？我的最近老污染，心累可能和你取的结肠癌有关，结肠本身就不是无菌区。我试过做胶质瘤里的TIL，PBS和培养基都加了双抗的。组织没用酶消化，修剪一下直接小块用筛网研磨，然后多晒网多过滤几次，没用酶消化，怕细胞活性不好

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七更七子石

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展开引用dxy_h2lc4whq可是过流式得把细胞消化成单个细胞，可我目前的酶不能完全把组织消化成单个细胞，这样会堵流式得柱子。请问您是怎么克服的呢？还有能不能把您当初做结肠癌的过程发我下，我想看看是哪一步污染了，昨天做的今晚去看又黄了，还有您去医院取组织是怎么取的。我感觉总这个方法污染太大了。组织在外爆率时间太长了。......组织分离单细胞的方法有很多，酶处理是一方面，还要同时用别的方法的，不是单细胞当然不能上FACS。你可以把你的portocol发给我，我帮你看看。还有，医院做完手术之后一部分会做病理，另一部分就用培养基或是PBS拿回来了。你运输是几个小时？

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dxy_h2lc4whq

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七更七子石组织分离单细胞的方法有很多，酶处理是一方面，还要同时用别的方法的，不是单细胞当然不能上FACS。你可以把你的portocol发给我，我帮你看看。还有，医院做完手术之后一部分会做病理，另一部分就用培养基或是PBS拿回来了。你运输是几个小时？1,医院取的组织放在冰的培养基中，放在有冰块的泡沫盒带回实验室，（路途大概两小时）2.用PBS洗三到五次，用双抗处理10min,3.剔除坏死的组织，血丝等，用剪刀剪成1mm3大小，（在培养皿里剪的）4.移到离心管中，加入5~6ml胶原酶，37℃，1h,(是放在孵箱里的，大概没5min拿出来摇一摇)5.离心去除胶原酶，PBS清洗2次，培养基清洗1次，（800r/min,5min,20℃)6.5ml培养基重悬，过70um过滤器，7.滤液进行磁珠筛选，然后移入无血清的培养基中进行悬浮培养这就是我的方案，但是做了三次三次都污染了，都是第二早上去看还可以，晚上去看，培养基全黄了，可以排除培养基，PBS的污染，因为我们同时还在做HT-29干细胞筛选，用的都是同样的培养基和试剂，都没有问题，感觉还是我的组织有问题，最后一次，我培养基中也家双抗了，双抗处理的浓度比正常的高了5倍，还是不可避免的污染了。还有就是每次医生都是把组织装在一个塑料手套里，（类似我们吃周黑鸭哪种手套，）然后递给我，我就立马把它放在培养基里，这个过程是暴露在外面的，会不会是这一步污染了。还有一个，天气原因，我四月分做过几次，不过是养肿瘤细胞，用多聚赖氨酸处理培养瓶，吧处理的滤液加进去，细胞有贴壁，但是不增值，自己就老化死掉了，后面是换了方案，直接培养干细胞，现在做就做一次染一次。请帮我看看，分析一下，多提提意见。谢谢

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七更七子石

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感觉不应该是运输或是暴露时间过长引起的，而且P/S处理的方法也可以。你可以试试一下步骤，1，前期运输和培养基清洗的时候不要用带血清的；2，所有buffer在处理之前尽量过滤灭菌；3，可以换一下针对结肠菌群的药物4，增加PBS清洗次数。我是用浓缩清洗，8变4，4变2，2变1，这种。清洗次数增加也能减少感染，还有，离心的时候可以增加离心时间，种上之后也要加快换液时间。还有，你如果连续污染的话，可以考虑换一个人帮你做一两次。你最好上一下照片，培养之后，和污染的时候。

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dxy_h2lc4whq

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展开引用七更七子石感觉不应该是运输或是暴露时间过长引起的，而且P/S处理的方法也可以。你可以试试一下步骤，1，前期运输和培养基清洗的时候不要用带血清的；2，所有buffer在处理之前尽量过滤灭菌；3，可以换一下针对结肠菌群的药物4，增加PBS清洗次数。我是用浓缩清洗，8变4，4变2，2变1，这种。清洗次数增加也能减少感染，还有，离心的时候可以增加离心时间，种上之后也要加快换液时间。还有，你如果连续污染的话，可以考虑换一个人帮你做一两次。你最好上一下照片，培养之后，和污染的时候。......嗯嗯，我觉得血清问题不大，我们老师买的是进口的胎牛血清，不过下次我试试不加血清，我pbs是高温灭菌后没有过滤直接使用的，还有那个浓度清洗我妹看懂，是先用8倍的双抗清洗，然后换4倍，再换2倍的双抗清洗么？还有我这儿只有刚消化下来的显微镜下图和第二天培养基变黄的图，镜下观察里面就有很多

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dxy_h2lc4whq

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展开引用dxy_h2lc4whq嗯嗯，我觉得血清问题不大，我们老师买的是进口的胎牛血清，不过下次我试试不加血清，我pbs是高温灭菌后没有过滤直接使用的，还有那个浓度清洗我妹看懂，是先用8倍的双抗清洗，然后换4倍，再换2倍的双抗清洗么？还有我这儿只有刚消化下来的显微镜下图和第二天培养基变黄的图，镜下观察里面就有很多......刚才按错键了，培养基变黄后在显微镜可以看到很多小点点，如下图一样

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不甜不咸

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这个非常适合筛选肿瘤干细胞http:看能帮到你不？版主yj1984ren留言:多次违规

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只是完美

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我是直接拿着50ml的离心管里面装了DMEM/F12给手术室，然后再拿回来的。但是我取得胶质瘤干细胞，本来我消化后，发现还是有好多红细胞，根本没办法计数，还有就是后面用了红细胞裂解液，数目可以了，发现根本不成球。不知道为什么？有什么建议吗？

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dxy_h2lc4whq

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只是完美我是直接拿着50ml的离心管里面装了DMEM/F12给手术室，然后再拿回来的。但是我取得胶质瘤干细胞，本来我消化后，发现还是有好多红细胞，根本没办法计数，还有就是后面用了红细胞裂解液，数目可以了，发现根本不成球。不知道为什么？有什么建议吗？我现在还在防污染这一步，还没到你那儿去，不过有问题我们可以一起交流，谢谢你给的提议哈。

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只是完美

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我加了双抗，

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dxy_h2lc4whq

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只是完美我加了双抗，请问你前期处理时怎么样呢？双抗处理组织的浓度和时间能告诉我下么？或者还会加一些其他抗生素之类的，我做原代一直污染，

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只是完美

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我是直接放在DMEM/F12中，回来放到PBS洗3次。PBS里面加了双抗。