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Recombinant (E. coli) Mayaro virus (MAYV) Capsid Protein (Brazil strain, full length, >95% Pure, His-tag)
Product Type | Recombinant Protein |
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2. 普通冻存管就可以,不用特意再去灭酶处理,因为RNA酶污染主要是内源性的,外界的很少,主要来自于人的皮肤、呼吸,戴好口罩手套就可以了,冻存管这些,影响很小忽略不计
3. 组织在液氮里冻硬了就可以拿到-80°保存,随时取用,不用长期在液氮里。当然我们是不会长期保存的,没有试过在-80°里呆一年。不过话说回来,除非是几千例标本的大型课题,一般都很少需要保存标本保存1年以上的吧,几十例一百例的东西,两三个月最多半年就处理掉了,所以我们做小课题的都是取到组织后立马放液氮,再转移到-80°
(仅供参考)
培养基:1640+10%FBS
消化条件: 预冷PBS浸泡5-10Min
细胞正常形态为圆形,贴壁生长,生长速度较快,细胞难消化,消化时用预冷的PBS淋洗,然后浸泡5min,让后用枪轻轻吹起吹散收集离心,这个过程很关键,如果没有消化到位就吹打或消化过久,细胞次日贴壁就会分化,分化之后的形态是细胞两端长出尖尖的触角,细胞不再圆形贴壁,而是平铺向四周扩散生长。
所以你换培养基试试看,我养的挺好的!
一、细胞冷冻保存
1.材料:
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法:
(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤:
(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。
(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项:
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。
(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如SigmaD-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。
(4)冷冻保存之细胞浓度:
①normalhumanfibroblast:1~3×106cells/ml
②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④othersUSPensions:5~10×106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败。
(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。
2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤:
(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。
(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。
(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理:
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。
(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料,如果细胞不易吸收trypanblue,则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。
2、材料:
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061);Erythosinbluishstain;取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。
3、步骤:
(1)取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例:
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;
细胞数/ml:60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106;
细胞数/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106
存活率:225/243﹦92.6%
吹打最好还是用弯头的,用起来更为方便
各位大神们,我的课题实验需要提取临床患者抗凝外周血的血浆进行冻存和后续研究,由于血样珍贵,老板让我把离心提取血浆之后所剩的沉淀也加以利用,从剩下的沉淀(血细胞)当中提取出白细胞并冻存,用于之后做western。我用自己的外周血标本试做了一下,5mlEDTA抗凝外周血,3000rpm4℃离心10min后,取上层血浆分装-80冻存用于相关ELAISA实验,然后在下层沉淀(血细胞)中加入3倍体积的溶血剂,静置10min使红细胞裂解之后离心,结果并没有明显的分层,我重复了加溶血剂裂解红细胞并离心的步骤,到最后的结果还是只能达到如图所示。可以看到一层灰白色物质,但无法完全分离提取白细胞,所以想请教各位大神:①我的操作中有哪些错误烦请大家指出;②我用的溶血剂是OptilyseC的溶血剂,是否是试剂的问题?是否需要购买专门的红细胞裂解液,或者自行配制?③为什么裂解红细胞之后分层并不明显,多次离心之后还是分不清楚?④如果可以提取出白细胞,是否可以直接加入冻存液将白细胞-80℃冻存用于之后的研究(主要是Western,不影响细胞内蛋白即可)?因为是第一次做实验,血样珍贵,这种处理方法做过的人也很少,烦请有经验的各位批评指正,向大家虚心请教学习,不胜感激!
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