一、试验原理

细胞培育可分为原代培育和传代培育。直接从体内获取的安排细胞进行初次培育为原代培育；当原代培育的细胞增殖到达必定密度后，则需求做再培育，即将培育的细胞涣散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培育，为传代培育，传代培育的累积次数即是细胞的代数。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，试验证实这么能够最大极限的保留细胞生机。现在细胞冻存多选用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能进步细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，削减细胞内冰晶的构成，然后削减因为冰晶构成形成的细胞损害。复苏细胞应选用敏捷消融的方法，这么能够确保细胞外结晶在很短的时间内即消融，防止因为缓慢消融使水分渗入细胞内构成胞内再结晶对细胞形成损害。

二、试验办法

资料：

小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培育皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培育瓶，培育液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培育箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。

办法：

（1）原代培育：

1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。

2.用镊子提起肌肤，用解剖剪剪开肌肤一个横切断，将肌肤向上扯开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左边找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培育皿中。

3.用生理盐水将取出的脾脏清洁屡次，并除掉剩余无用的安排。

4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，悄悄在筛网上进行碾磨，一起不断滴加不含血清的培育液冲刷。

5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去掉血液等）。

6.参加10ml培育液，吹打混匀，取样计数。

7.将稀释好的细胞悬液分装于培育瓶中，悄悄摇晃混匀，在培育瓶上。

面做好象征，注明细胞、组别及日期。然后将培育瓶置于二氧化碳培育箱中培育。

（2）传代培育：

1.倒置显微镜下调查细胞形状，确定细胞是不是需求传代。

2.培育液瓶打开后，过酒精灯火焰，置酒精灯火焰周围。

3.拿出直头滴管，套上橡皮吸头，过火，放入培育液瓶中。

4.打开培育瓶，瓶口过火，将培育瓶内的培育液悄悄倒入废液缸，用2-3mLPBS洗去残留的旧培育基。

5.培育瓶参加0.25%胰酶，用量以薄薄盖满一层为宜，37℃消化，倒置显微镜下调查到细胞收回突起变圆时当即翻转培育瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，参加少数的含血清的新鲜培育基。

6.取弯头滴管重复吹打细胞使其脱壁并涣散，再依据分传瓶数补加必定量的含血清的新鲜培育基，制成细胞悬液，然后分装到新培育瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍反转，以利于CO2气体的进入，将培育瓶放回CO2培育箱。

7.对半贴壁培育细胞，不需胰酶，直接吹打，参加新鲜培育基，然后分装到各瓶中。

（3）冻存：

1.汲取传代后的细胞悬液，离心，去掉培育液，参加冻存液，分装冻存管（冻存管内细胞数目通常为（5～10）×106个/ml，2ml冻存管中通常放1～1.5ml细胞）。

2.按步冻存

o冷冻保留办法一：规范的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可敏捷浸入液氮中。

o冷冻保留办法二：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮长时间保留。

（4）复苏：

1.取出冷冻管，当即放入37℃水浴箱中敏捷冻结，轻摇冷冻管使其在1分钟内悉数消融，移入无菌操作台内。

2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

3.1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

4.加恰当培育液后将细胞转移至培育瓶中，37℃培育，第二天调查成长状况。

三、试验成果核算

1.一只小鼠可获得（1～2.5）×108个脾细胞。

2.细胞接种后通常几小时内就能贴壁，并开端成长，如接种的细胞密度适合，5天到一星期即可构成单层。

3.通常状况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培育瓶壁上，2～4天就可在瓶内构成单层，需求再次进行传代。

四、留意事项

1.选材要求新鲜，无菌，解剖小鼠时，留意不要损害脾脏及其周围的脏器，尤其是肠道等，防止污染脾脏。

2.冲刷脾脏时要尽量洗净血污，去掉无用安排，并要防止安排枯燥。

3.碾磨后及时用清水冲刷筛网，防止安排、细胞堵塞网孔。

4.计数前，留意吸尽平皿里的细胞，充沛混匀，使细胞分散成单个细胞。

5.试验操作应在操作台中心无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

6.金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才干挟取安排，防止构成安排损害。

7.另外胶塞过火焰时也不能时间长，防止烧焦发生有毒气体，损害培育细胞。

8.汲取过营养液后的吸管不能再用火焰炙烤，因残留在吸管头中营养液能烧焦构成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。

9.不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等一切可能与细胞触摸的有些，如已触摸，要用火焰炙烤消毒或取备品更换。

10.敞开、封闭长有细胞的培育瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。

11.换液时倾倒废液，瓶口不能触摸废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。

12.吹打细胞时，要留意边角的细胞是不是吹打下来。

13.手或相对较脏的物品不能通过敞开的瓶口上，即不可以在敞开容器上方操作。

14.每次操作只处理一株细胞，防止构成细胞穿插污染。

15.留意本身的安全，关于来自人源性或病毒感染的细胞株应格外当心。操作过程中，应防止引起气溶胶的发生，当心有毒性试剂例如DMSO，并防止尖利物品伤人等。

16.从增殖期到构成细密的单层细胞曾经的培育细胞都可以用于冻存，但最佳为对数成长期细胞。在冻存前一天最佳换一次培育液。

17.将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护作业，防止冻伤。

18.冻存和复苏最佳用新配制的培育液。

最近与战友们探讨原液冻存的问题，各家做的五花八门，做法各不相同。

有的-20度冻存的（有的项目有问题，有的没问题）、有-35度冻存的，有-60度冻存的，有-80度冻存的。

冻存的因素：冻存温度，这个文献等于没说（依据是啥，@fjj8802战友说低于玻璃化转变温度，是否还有别的考虑）、冷冻速率（快，快到什么程度），冻时间（完全冻上，这个貌似需要估计吧，尤其是大量的，如何靠小模型能看出来）、融化温度、融化速率（搅拌）、规模（这个还真不好靠模型来评估）。评估如何来评估冻存的质量好坏，有人说冻融循环，这个小模型适合看蛋白是否对冻融敏感，但是不能很快知道这个蛋白长期冻存的稳定问题。

开本帖探讨原液冻存的注意事项及依据，战友们也可以谈谈自己家目前的做法。

链接：

//d.dxy.cn/detail/12769151

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