The CellAmp Whole Transcriptome Amplification Kit (Real Time), Ver. 2 enables you to go from cells to cDNA that is ready for analysis by real-time PCR. When using conventional techniques for working with trace amounts of nucleic acids, loss of product during purification steps is a frequent problem. However, this cells-to-cDNA kit ensures good product yield because loss-inducing purification steps for RNA and cDNA are not required.
The CellAmp Whole Transcriptome Amplification Kit (Real Time), Ver. 2 enables you to go from cells to cDNA that is ready for analysis by real-time PCR. When using conventional techniques for working with trace amounts of nucleic acids, loss of product during purification steps is a frequent problem. However, this cells-to-cDNA kit ensures good product yield because loss-inducing purification steps for RNA and cDNA are not required.
The procedure begins with cell lysis, followed by a reverse transcription reaction with the dT adapter primer (RT dT Primer 2) to synthesize cDNA from mRNA. Next, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) is used to add a dA tail to the synthesized cDNA. The resulting 3" dA tail containing cDNA product is used as direct template for PCR, resulting in fewer required amplification cycles.
In addition to moving from cells to cDNA, this product can be used to amplify cDNA from trace amounts of RNA.
The CellAmp Whole Transcriptome Amplification Kit (Real Time), Ver. 2 uses an additional exonuclease I treatment step, which helps suppress nonspecific primer-derived amplification and increases yields of low-expressed genes.
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各位大神们，我的课题实验需要提取临床患者抗凝外周血的血浆进行冻存和后续研究，由于血样珍贵，老板让我把离心提取血浆之后所剩的沉淀也加以利用，从剩下的沉淀（血细胞）当中提取出白细胞并冻存，用于之后做western。我用自己的外周血标本试做了一下，5mlEDTA抗凝外周血，3000rpm4℃离心10min后，取上层血浆分装-80冻存用于相关ELAISA实验，然后在下层沉淀（血细胞）中加入3倍体积的溶血剂，静置10min使红细胞裂解之后离心，结果并没有明显的分层，我重复了加溶血剂裂解红细胞并离心的步骤，到最后的结果还是只能达到如图所示。可以看到一层灰白色物质，但无法完全分离提取白细胞，所以想请教各位大神：①我的操作中有哪些错误烦请大家指出；②我用的溶血剂是OptilyseC的溶血剂，是否是试剂的问题？是否需要购买专门的红细胞裂解液，或者自行配制？③为什么裂解红细胞之后分层并不明显，多次离心之后还是分不清楚？④如果可以提取出白细胞，是否可以直接加入冻存液将白细胞-80℃冻存用于之后的研究（主要是Western，不影响细胞内蛋白即可）？因为是第一次做实验，血样珍贵，这种处理方法做过的人也很少，烦请有经验的各位批评指正，向大家虚心请教学习，不胜感激！
培养基:1640+10%FBS
消化条件: 预冷PBS浸泡5－10Min
细胞正常形态为圆形,贴壁生长,生长速度较快,细胞难消化,消化时用预冷的PBS淋洗,然后浸泡5min,让后用枪轻轻吹起吹散收集离心,这个过程很关键,如果没有消化到位就吹打或消化过久,细胞次日贴壁就会分化,分化之后的形态是细胞两端长出尖尖的触角,细胞不再圆形贴壁,而是平铺向四周扩散生长。
所以你换培养基试试看，我养的挺好的！
1、毕氏酵母氯化锂转化法
(1)试剂1M LiCl(用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释)50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装)2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;
(2)感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约108 Cells/ml);收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min;重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管;离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中;按50ul/管分装，立即进行转化;注：不要将感受态酵母菌冰浴;
(3)毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA;将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液;对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);30℃水浴孵育30min;42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体;重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育;1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定;
2、毕氏酵母PEG1000转化法
(1)试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol缓冲液B：40%(w/v)PEG1000(sigma)，0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行);
(2)待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜;取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8;室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次;重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存
(3)毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率;37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次;取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀;30℃水浴孵育1h;室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中;离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中;将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定;
3、毕氏酵母电转化法
(1)E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。37℃，200 rpm，培养16～18小时。灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10%甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压 2500 V，时间 5 ms。电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB-Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃ 培养12～16小时。
(2)线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻;
1)将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中，加入5-20μg线性化质粒(5～10μl)，轻弹混匀，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中;
2) 转化杯置于冰浴中5～10分钟，保持低温。
3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V;电阻：400Ω;电容：25μF;脉冲时间：10mS;一次电击。
4) 电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中;5) 取30℃烘至表面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 （一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二） 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心， 1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。向左转|向右转
2. 普通冻存管就可以，不用特意再去灭酶处理，因为RNA酶污染主要是内源性的，外界的很少，主要来自于人的皮肤、呼吸，戴好口罩手套就可以了，冻存管这些，影响很小忽略不计
3. 组织在液氮里冻硬了就可以拿到-80°保存，随时取用，不用长期在液氮里。当然我们是不会长期保存的，没有试过在-80°里呆一年。不过话说回来，除非是几千例标本的大型课题，一般都很少需要保存标本保存1年以上的吧，几十例一百例的东西，两三个月最多半年就处理掉了，所以我们做小课题的都是取到组织后立马放液氮，再转移到-80°
（仅供参考）
吹打最好还是用弯头的，用起来更为方便
