rPeptide是一家生物化学公司,坐落于美国乔治亚州,与雅典毗邻。该公司研发试剂是市场领跑者。主要产品涉及领域为老年性痴呆症与帕金森综合症研究使用的重组蛋白,重组多肽,抗体以及试剂等等,并成为了该领域的领导者。同时,该公司提供一系列外包服务,从分子生物学,蛋白表达与蛋白纯化到13C与15N统一标记蛋白与多肽。rPeptide技术平台可解决可溶性多肽/蛋白(例如:β-淀粉样蛋白、廋蛋白、前胰岛素)在大肠杆菌中表达等历史性难题。
1、Beta-AmyloidPeptides β-淀粉样多肽系列产品
2、 Proteins 蛋白系列产品
3、 Labeledpeptides&proteins 标记多肽与标记蛋白系列产品
4、MonoclonalAntibodies 单克隆抗体系列产品
5、PolyclonalAntibodies 多克隆抗体
6、Bydisease 人类疾病相关产品
7、Contractservices 外包服务
7.1 RecombinantExpressionofPeptidesandProteins 多肽与蛋白重组表达
7.2 UniformLabelingofPeptidesandProteins 多肽与蛋白进行标记
7.3 SyntheticPeptideSynthesis 多肽合成
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RMgX + RX = R-R + MgX2.
这个反应需要的能量比生成格氏试剂的高,
因此降低反应温度是第一个选择。
其次, 增加镁得摩尔比, 让 RX与镁有更多机会反应, 而不是与RMgX。
第三, 降低RX的浓度, 即用更多的溶剂, 因为溶剂和格氏试剂有很显著的溶剂络合。
第四, 缓慢滴加RX., 即降低RX.在反应体系的浓度。
第五, 增加搅拌速率, 即, 让RX.与镁有更好的接触。
、
Cell-Based ELISA
的优点:
Cell-Based ELISA
(基于细胞的
ELISA
)是一种全新的
ELISA
技术,有两个最突出的优点:
1.1
不需要抽提蛋白、包被微孔板:细胞直接在微孔板里培养,待检测的时候,将细胞固定在微孔板上并
进行通透处理即可。这样就避免了抽提蛋白时,由于客观和主观上引起样品的损失而导致实验结果在一定
程度上偏离了实际情况。
同时不用包被微孔板,
简化了实验流程,
有助于提高效率。
科研人员在一个
96
孔
酶联板上,便能检测目标细胞蛋白经刺激或抑制作用后的表现。由于省去抽提蛋白和裂解细胞的步骤,样
本的损失也能降到最低,比起其他普通的
ELISA
测定方法,这项全新的
ELISA
技术能更快速、更方便
地一次检测大量的细胞内蛋白。
1.2
可同时检测两种不同蛋白:
封闭后加入两种抗不同蛋白且来源于不同宿主的一抗,
然后再加入不同的
二抗,加入两种荧光底物,检测两个波长。同时检测两种蛋白的好处是显而易见的,可以减少工作量,此
外还可以满足一些特殊的实验需要,例如,需要测定某个蛋白的磷酸化比例,就需要测定磷酸化蛋白的数
量和总蛋白的数量,这两个测定在同一次实验进行,有助于消除实验误差,得到更为精确的实验结果。
2
、
Cell-Based ELISA
的两种技术:
某些公司发展了双通道
Cell-Based ELISA
技术;
双通道与单通道
Cell-based ELISA
比较:
双通道
cell-based ELISA
,顾名思义,即一次可以同时检测两种目的蛋白,
R&D Systems
提供的
Cell-based ELISA
就是双通道
cell-based ELISA
,原理略:(需要荧光检测方式和相应仪器);
单通道
cell-based ELISA
,即一次只能检测一种目的蛋白,他和普通
ELISA
的主要区别在于样品处理过
程
3
、
cell-based ELISA
的应用:
该产品,最多发展起来的是用于检测磷酸化和非磷酸化蛋白的相对含量;
4
、有
cell-based ELISA
产品的公司:目前,多家
elisa
产品提供
商均
提供
cell
based
elisa
试剂盒,
如
Rnd
systems
,
raybiotech
,
ebioscience
,
millipore
等公司;
5
、如何自己进行
cell based elisa
实验?
事实上,根据单通道的
cell based elisa
原理,可以自己建立
cell based elisa
实验系统;
细胞加入培养板中;
加入刺激物或者抑制剂进行培养;
对细胞进行固定或者封闭;
加入第一抗体;
加入
HRP
结合的二抗(二抗的选择,同
western blot
);
加入底物进行显色;
成纤维细胞生长抑制试剂盒—FibrOut™ 是由多种生化复合物组成的混合物、抗体或特殊的试剂。它能够抑制成纤维细胞过度增长或污染从而有效地增加靶细胞的产量。每种成纤维细胞生长抑制试剂盒都可定制到特定组织和特定细胞,经验证可与对应的PrimaCellTM系统高效协同工作,可为您带来每一类原代细胞培养的最佳结果。每种成纤维细胞生长抑制试剂盒都配备了最合适的缓冲液。
FibrOut™ 是一种包含几种生化复合物和试剂的完整系统,它在原代细胞培养中能抑制成纤维细胞增殖,从而促进靶细胞生长。每种成纤维细胞生长抑制试剂盒都可定制到特定组织和特定细胞,经验证可与对应原代细胞培养试剂盒-PrimaCellTM高效协同工作,可为您带来每一类原代细胞培养的最好结果。每种成纤维细胞生长抑制试剂盒都配备了最合适的缓冲液。成分包括 (1)胰蛋白酶;(2)胶原酶;(3)D-缬氨酸;(4)顺式羟基脯氨酸;(5)硫柳汞;(6)苯巴比妥;(7)系列血清替代品;(8)抗中胚层带抗体。
参考文献:
1. Cancer Res. 2010 May 1;70(9):3537-46,Epub 2010 Apr 20. Requirement of the NF-kappaB subunit p65/RelA for K-Ras-induced lung tumorigenesis. Bassères DS, Ebbs A, Levantini E, Baldwin AS.
2. Nat Commun. 2013;4:1795. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Jung Y, Kim JK, Shiozawa Y, Wang J, Mishra A, Joseph J, Berry JE, McGee S, Lee E, Sun H, Wang J, Jin T, Zhang H, Dai J, Krebsbach PH, Keller ET, Pienta KJ, Taichman RS.
3. Mol Biol Cell. 2012 Jul;23(14):2755-69. Calcium-calmodulin kinase I cooperatively regulates nucleocytoplasmic shuttling of CCTα by accessing a nuclear export signal. Agassandian M, Chen BB, Pulijala R, Kaercher L, Glasser JR, Mallampalli RK.展开
该试剂盒是一种时间分辨的荧光共振能量转移免疫分析,该反应是一个竞争免疫反应,即铕标的cAMP示踪复合物与体系中的cAMP竞争结合标有Alexa Fluor 647染料的cAMP抗体。铕标cAMP示踪复合物是通过Biotin标记的cAMP与铕标的抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)与抗体的复合物紧密结合产生的。
当抗体结合到示踪剂上时,340nm的激发光激发铕标分子,导致能量转移到Alexa Fluor 647染料上,结果产生665nm的发射光。荧光的强度与样品中的cAMP含量成反比。
本试剂盒用于检测在GPCR激动剂刺激下活细胞或者细胞膜制备品产生的cAMP。对于偶联Gαs的受体,激动剂刺激导致665nm的荧光强度降低,而拮抗剂则可以逆转这一效应;对于偶联Gαi的受体,在激动剂刺激的同时用forskolin刺激cAMP产生,那么激动剂则抑制forskolin诱导的cAMP的生成,因此对照只给forskolin的细胞组可以通过665nm荧光强度的增加反应激动剂的效应。
该试剂盒的灵敏度很高,室温下反应在20h内是稳定的。本试剂盒适用于在384孔板中进行24μl的微量分析。
2.微孔板:选择实验所需的板条数。剩余不用的部分随同干燥剂密封放回原袋。 1.包被有抗抑制素bB亚单位抗体的微孔板(Anti-InhibinB-CoatedMicrotitrationStrips):96孔,2-8ºC下密封保存。
2.标准品A/样本稀释液(InhibinBStandardA/SampleDiluent):2ml×1瓶,胎牛血清,含0pg/mL二聚体抑制素B。使用前2-8ºC下保存。打开后2-8ºC下可保存2周。于-20ºC可长期保存。
3.标准品B-G(InhibinBStandardsB-G):1ml×6瓶,胎牛血清,含二聚体抑制素B的浓度为10,30,100,250,500,1000pg/mL。使用前2-8ºC下保存。打开后2-8ºC下可保存2周。于-20ºC可长期保存。
4.质控(InhibinBControls):1ml×2瓶,浓度I、II,胎牛血清,含低浓度和高浓度的抑制素A二聚体。使用前2-8ºC下保存。打开后2-8ºC下可保存2周。于-20ºC可长期保存。
5.样本稀释液A(InhibinBSampleBufferA):10ml×1瓶,2-8ºC下保存。
6.样本稀释液B(InhibinBSampleBufferB):10ml×1瓶,2-8ºC下保存。
7.抗体-生物素结合物(InhibinBAntibody-BiotinConjugate)(即用型):10ml×1瓶,含生物素标记的抗抑制素a亚单位抗体。2-8ºC下保存。
8.酶结合物(浓缩)(Streptavidin-EnzymeConjugate)(即用型):10ml×1瓶,含链霉和素-辣根过氧化物酶结合物。2-8ºC下保存。
9.TMB底物溶液(TMBChromogenSolution):15ml×1瓶,2-8ºC下保存。
10.终止液(StoppingSolution):15ml×1瓶,为0.2M的硫酸。2-8ºC下保存。
11.浓缩洗液(WashConcentrate):100ml×1瓶,2-8ºC下保存。 操作前所有试剂都应平衡至室温(~25ºC)并充分混匀。标准品、质控及待测样本需同时做双份。
1.取出实验所需板条,并记录各孔位置。
2.在对应的孔中加入标准品、质控及待测样本各50ul。
3.每孔加入25ul样本稀释液A。
4.每孔加入25ul样本稀释液B。
5.封板,以300-400rpm速度震荡,室温下过夜(14-18小时)。
6.洗板3次,在吸水纸上拍干。
7.每孔加入50ul抗体-生物素结合物。
8.封板,以500-700rpm速度震荡,室温下孵育1.5小时。
9.洗板6次,在吸水纸上拍干。
10.每孔加入50ul链霉和素-辣根过氧化物酶结合物。
11.封板,以500-700rpm速度震荡,室温下孵育20分钟。
12.洗板6次,洗完最后一次以后,将洗液在孔内停留15分钟再除去。在吸水纸上拍干。
13.在每孔中加入100ulTMB底物溶液。
14.以500-700rpm速度震荡,室温下避光孵育15-30分钟。
15.每孔加入100ul终止液。
16.30分钟内在450nm处读数。
注:必须以零标准作空白。如果能做到双波长测定,可在600或620nm处读数,将600(620)nm吸收值从450nm处减去,这样可以减少光学误差。 使用血清样本,静脉穿刺术采集血液。样本于2-8ºC可保存24小时,-20ºC或以下可保存30天。避免反复冻融样本。不应采用溶血或脂血的样本。冰冻的样本在实验前应解冻,并充分混匀。向左转|向右转
抑制剂刺激细胞后,需要用PBS清洗后再做后续实验吗