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TransfectionReagentforHCN-1ACells(BrainNeuronalCells,CRL-10442)
- Twocomponentformulationenhanceslipidmediatedtransfectionefficiency
- Optimizedeasy-to-usetransfectionprotocolprovidedfortransfectionofsiRNA,DNA,mRNA,andmicroRNA
- KitincludesTransfectionEnhancerreagentandrecommendedtransfectionprotocol
- Hightransfectionefficacyinthe presenceofserum
- ExpandyourRNAiapplicationwithareagentoptimizedfordeliveryofbothsiRNAandplasmid
- ReproducIBLetransfectionresults
- DownloadHCN-1Atransfectionprotocol:[PDF]
- Download HCN1ACRISPR/Cas9transfectionprotocol:[PDF]
- DownloadPowerPointpresentationforHCN-1Acellstransfectionkit:[PPT]
- DevelopedandmanufacturedbyAltogenBiosystems
TransfectionEfficiency:
Reagentexhibitsatleast76%transfectionefficiencyofsiRNAdelivery.TransfectionefficiencywasdeterminedbyqRT-PCR.
TransfectionProtocolandMSDS:
DownloadAltogenBiosystemsHCN1ATransfectionProtocol:[PDF]
DownloadMSDS:[PDF]
HCN-1ACellLine:
AnumberofstudieshavedemonstratedthesuccessfulapplicationofRNAiinprimarycellculturesandnon-neuronalcelllines;however,theuseofgenesilencinginneuronalcelltypeshasbeennotoriouslydifficultbecauseofseveraltechnicalandBIOLOGicallimitations.NeuronsarethemostresistanttoRNAianddifficulttocharacterizeonthemolecularlevelduetotheirheterogeneousnatureandlimitedLifespan.Methodstoconsiderwhenperformingnucleicaciddeliveryexperimentswithneuronalculturesincludeelectroporation,microinjection,viral-basedmethods,andcertainchemicaltransfectionreagents.AlthoughphysicaldeliverymethodsappeartobeefficientforsiRNA-inducedstudieswheretransientmodificationofgeneexpressionissufficient,thesemethodsdonotseemtobeadequateforbehavioralstudieswherelong-termalterationofgeneexpressionmaybenecessary.Theviral-basedsiRNAexpressionsystemsappeartobemostapplicabletobothCentralNervousSystem(CNS)genetherapyandbasicneurobiologicalstudies.LentiviralvectorshavebeenreportedlyusedsuccessfullyforthedeliveryofshorthairpinRNA(shRNA),aprecursorofsiRNA,intoprimaryneuronstoinduceRNAi.
TheHCN-1Acelllineisahumancorticalneuronallinewasderivedfroman18month-oldfemalewithintractableseizures.Treatmentincludedahemispherectomy.TheHCN-1Acelllinehastheabilitytodifferentiate,displayingmaturemorphologyafterdifferentiationwithsignificantlyslowergrowthrates. HCN-1Aarefrequentlyusedtomodelneuronalprocessesforscientificpurposes. HCN-1Acellshavebeenshowntotestpositiveforsomatostatin,glutamate,neuron-specificenolase,tubulin,vimentin,gamma-aminobutyricacid,vasoactiveintestinalpeptide,andcholecystokinin-8.Thecellstestnegativeforglialfibrillaryacidicprotein,andmyelinbasicprotein.DifferentiationofHCN-1Acanbeinducedthroughculturingthecorticalneuronalcellswithamixtureofnervegrowthfactor,dibutyrylcyclicadenosinemonophosphate,and1-isobutyl-3-methylxanthine.WhenHCN-1Acellsdifferentiate,theytakeonmaturemorphologywhichsignificantlyslowstheirgrowthrate,withadoublingtimeexceeding120hours.AfterHIV/N1Tinfection,HCN-1Adiminishedinsizeandsmallneuriteswereobserved.TransfectionstudiescarriedoutusingtheHCN-1Aneuronalcelllineareanessentialtoolinneurologicalresearch.AltogenBiosystemsprovideshighlyefficientlipid-basedtransfectionreagentkitsfortheHCN-1Acellline.
Data:
Figure1.GAPDmRNAlevelswerequantifiedusingreal-timeRT-PCRintheHCN1AcellstransfectedwithsiRNAstargetingGAPDornon-silencingsiRNA.Forty-eighthourspost-transfection,thecellswereharvestedandanalyzedbyreal-timeRT-PCRforGAPDmRNAexpressionlevels.Datawerenormalizedagainstthe18SrRNAsignal.Controlsampleswereeithermock-transfectedoruntreated.Valuesarenormalizedtountreatedsample.Dataaremeans±SD(n=5).
Figure2.ProteinexpressionofGAPDHinHCN-1Acells.DNAplasmidexpressingGAPDHorsiRNAtargetingGAPDHweretransfectedintoHCN-1AcellsfollowingAltogenBiosystemstransfectionprotocol.At72hourspost-transfectionthecellswereanalyzedbyWesternBlotforproteinexpressionlevels(normalizedbytotalprotein,10µgoftotalproteinloadedpereachwell).Untreatedcellsusedasanegativecontrol.
SelectedHCN1Atransfectionkitcitations:
- JournalofBiologicalChemistry.2011.RegulatoryFactorX1-inducedDown-regulationof Transforming…Fengetal[PDF]
- CancerResearch.201171(15):5144-53.InhibitionofmiR-193aexpressionby…Iliopoulosetal[PDF]
- RNA.201016(11):2108-19.RNaseLreleasesasmallRNAfromHCVRNAthatrefolds…Malathietal[PDF]
HCN-1ATransfectionReagent
AltogenBiosystems:
AltogenBiosystemstransfectionandelectroporationproductsforlifesciencesandcancerresearch.Companydevelopedtwotypesofinvivodeliverykitsforanimalresearch:Tissue-targetedreagents(deliverytoliver,pancreas,andkidneytissues),andbroadrangeinvivodeliveryreagents(PEG-Liposome,Nanoparticle-based,Lipid-based,andPolymer-basedkits). Advancedformulationofreagentsandoptimizedtransfectionprotocolsprovideefficientintracellulardeliveryofproteins,DNA,mRNA,shRNA,siRNA,andothernegativelychargedmoleculesinvitroandinvivo.Readmore abouttransfectiontechnologyatAltogen’sTransfectionResource.
AltogenLabsResearchServices:
AltogenLabsprovidesGLP-compliantcontractresearchstudiesforpre-clinicalresearch,INDapplications,anddrugdevelopment.BiologyCROservices include:Xenograftmodels(30+),developmentofstablecelllines,ELISAassaydevelopment,cell-basedandtissuetargetedRNAistudies,safetypharm/toxassays,andotherstudies(visitAltogenLabs.com).
VolumeOptions:
- 0.5ml(Catalog#1759)
- 1.5ml(Catalog#1760)
- 1.5mlCRISPR(Catalog#2146)
- 8.0ml(Catalog#7043)
AltogenBiosystems是一家开发和制造用于生命科学研究，药物发现和开发的转染试剂盒的生物技术公司。转染试剂盒针对特定癌细胞系和原代细胞培养进行了优化，可将生物分子有效递送到靶组织中。通过先进的试剂配方和优化的转染方案实现体外（癌细胞系）和体内（动物组织靶向试剂、癌细胞系）递送货物分子，包括质粒DNA，各种类型的RNA（mRNA，siRNA，shRNA，microRNA），蛋白质和小分子研究。
Altogen生命科学公司致力于研发，生产和销售特定细胞系的转染试剂，用于细胞间生物分子的传递，并通过对转染试剂类型的设计将siRNA和质粒DNA有效地转入不同的细胞系和原代细胞内。Altogen公司开发的聚合物，脂质体，纳米粒子为基础的转染技术分别针对分子生物学，组合化学，和细胞生物学而分别应用。Altogen定制服务提供符合GLP要求定制研究服务，包括代稳定的细胞系，细胞银行和冷冻保存，焦磷酸测序，克隆，RNA干扰（RNAi）和基因沉默服务，发展分析，siRNA文库筛选，并转染服务。稳定的肿瘤细胞株和原代细胞的产生，可以是非常昂贵和费时。该公司的细胞培养科学家的细胞株的选择，无论是利息或shRNA表达载体的稳定表达的基因改造。标准的RNAi技术服务，包括设计与合成的siRNA的利益，验证siRNA的沉默效率，siRNA转染条件的优化，使高效的基因沉默细胞系或原代培养细胞的靶基因。转染培养细胞的瞬时或稳定的引入外源性分子和遗传物质（即RNA或DNA），通常是在生物实验室用来研究基因功能，基因表达的调节，生化映射，突变分析，和蛋白质的生产。科学家利用各种载体分子，这种分子，使质粒DNA（PDNA），信使RNA（mRNA），短干扰RNA（siRNA），小分子RNA（miRNA）的，并进入肿瘤细胞株和原代细胞的蛋白质的基因交付。不幸的是，无单提货的方法或转染试剂，可以适用于所有类型的细胞，细胞的细胞毒性和转染效率显着不同，取决于试剂，协议，并正在利用细胞类型。Altogen生物系统公司提供超过60种类型的细胞的预优化转染试剂盒。纳米粒子，脂质和聚合物基ALTOGEN®在体内转染试剂，使交付功能的RNA和DNA分子在体内。PEG脂质体在体内输送系统减少由于PEG修饰的先天免疫反应，并提供高效的siRNA转染的DNA，并在体内的蛋白质。由科学“杂志（2010年12月17日）：PEG脂质体在体内转染试剂盒siRNA的特色Altogen生物系统功能的特定细胞系转染试剂盒
120+细胞转染试剂和活体组织靶向试剂盒制造商AltogenBiosystems是一家生物技术公司，开发和制造用于生命科学研究、药物发现和开发的转染试剂盒。Altogen®体内转染试剂可有效地将生物分子导入靶组织。细胞转染试剂盒针对特定的癌细胞系和原代细胞进行了优化。通过先进的试剂配方和优化的转染方案实现货物分子（DNA、RNA、蛋白质）的高效传递。AltogenBiosystems利用高分子化学、分子和细胞生物学的专业知识，开发了新的体内外给药技术。转染是将外源分子导入培养细胞中，常用于研究基因功能、基因表达调控、生化定位和蛋白质生产。不幸的是，由于细胞毒性和转染效率的差异很大，并且取决于所使用的试剂、方案和细胞类型，因此没有一种单一的传递方法或转染试剂可应用于所有类型的细胞。AltogenBiosystems为120多个癌细胞系和原代细胞类型提供优化的转染试剂盒和电穿孔产品。体内转染试剂可实现组织靶向给药。Altogen的转染试剂盒包括用于体外（癌细胞系）和体内（用于动物研究的组织靶向试剂）转染的转染增强剂试剂和转染复合物冷凝器。Altogen实验室提供符合GLP的实验室合同研究服务。我们的生物CRO服务包括异种移植物的疗效、IND应用的pharm/tox研究和安全性测试、分析开发（ELISA、IC-50、qPCR）、90多个异种移植物动物模型、RNAi和基因沉默服务。Altogen的细胞培养科学家通过在28天内培育出稳定的细胞系，将选择的细胞系转化为稳定表达感兴趣的基因。
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目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡；
转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害；
细胞贴壁转染之后没有正常换液。
建议：考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统；摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试义翘转染试剂sinofection；对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考虑添加一些血清来帮助细胞恢复健康。
以上所有分析、建议的前提是，细胞培养、无菌操作等等都没有问题。祝顺利，加油~
但是有在转染前，将细胞进行重新传代的情况，这样做的目的在于保持细胞的活性状态。
“转染前将细胞以1.5-4.5X104 cells/well 的量(具体接细胞数请参考表1）接种在孔板中，于37℃， 5%CO2 的条件下进行培养，18-24小时（ sf9细胞为3-4小时）后转染。”
实验室一直都是用日常型质粒抽提试剂盒，转染细胞没问题。
我觉得只要是注意以下2点就可以了：
1，注意大肠杆菌(Escherichia coli)本身的污染，收集菌体沉淀时防止菌液散落，经常用75%的乙醇擦拭手套。
2，最后洗脱时最好使用无内毒素的水，我们是用注射用水的。
无论是小提还是大提我们都是用的日常型的，并没有刻意用转染级的，因为转染量大，去内毒素的操作太麻烦，损失太大。
其次要看下你选择单位的规模如何，做的比较好的，还是上海这边的，你可以看下基尔顿生物，原代细胞培养，动物造模，整体课题外包。
细胞状态与密度；转染试剂的类型、用量；DNA的品质、用量；转染复合物的品质、作用细胞的时间长度。
大家都是用什么方法挑选细胞单克隆的
单克隆：单克隆是指‘子代来源于一个母体.
细胞培养：细胞的大规模克隆.细胞培养,既包括微生物细胞的培养,细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞.
单克隆一般常指动植物细胞的克隆,细胞培养一般是指动物、微生物等细胞的细胞克隆.
二者没有什么明显区别.单克隆在单克隆抗体制备中比较常见.其实是对骨髓瘤细胞的细胞培养.
各位版友求助，
我使用Hek293构建转染模型，瞬转5质粒，用lipo2000做转染体系。
转染48h，发现荧光较强的细胞都在爬片的边缘，比例十分少。是因为我添加试剂的手法不对吗。
同时也发现加入转染体系后细胞状态特别差。想问一下用lipo2000时可以用无双抗的10%FBSDMEM吗。我转染前6h现在用的是纯DMEM，不含FBS。
请各位大神帮忙
我刚开始做转染，悬浮细胞，分别做过表达和敲减，看了很多文献，大都没有提及转染后是用转染的这同一批细胞同时做pcr，wb，cck8，凋亡，细胞周期；还是说这次转染只做pcr或wb，再转染一次做cck8或细胞周期。剩下的功能试验均同前，转染一次做一次？我养的是悬浮细胞，转染后做cck8这些功能试验前需要离心换液吗？跪谢解答！
