Description: KnockdownefficacycomparisonofGenMuteTransfectionReagent(upperpanel)vs.Dharmafect4siRNATransfectionReagent(middlepanel)andLipofectamine2000(lowerpanel)onHEK293cells.siRNAtargetingrenillaluciferaseatdifferentfinalconcentrationsrangingfrom0.5to20nMwasco-transfectedwithrenillaluciferasegene(0.5µgofpRL-CMVDNAperwell)bytheabovethreetransfectionreagentspermanufacturers"protocolsintoHEK293cellsgrowingona24-wellplate.Renillaluciferaseactivitywasdetermined24hafterpostco-transfectionwithrenillaluciferasedeterminationsystem(Promega).Theluminescencewasmeasuredfrom5.0µloflysateduring10sintegrationwithaluminometer(BeckmanCoulterLD400).Luciferaseactivitywasexpressedaslightunitsintegratedover10s(RLU)andnormalizedpermgofcellproteinbyusingtheBCAassay.Theerrorsbarsrepresentstandarddeviationderivedfromtriplicateexperiments.Luciferase-silencingefficiencywascalculatedrelativetountreatedcells.WhileGenMuteandDharmafect4reagentsdeliveredsignificantgenesilencingfrom1.0nMofrenillaluciferasesiRNA,lipofectamine2000gavegoodknockdownonlyafter30nM(datanotshown).
GenMuteReagentisanovelbiodegradablenon-LiposomalsiRNA/miRNA&DNAdeliverytool.WithourproprietarypHDependentConformationalChange(PDCC)technology,thebiodegradabletransfectionreagentwasformulatedbyadditionofpre-screenedhydrophobicgroupstoitssidechain,makingGenMuteReagentaversatileandmostpowerfulgenedeliverytoolinthemarket.GenMuteReagenthavebeenvalidatedtoeffectivelyandreproducIBLytransfectsinglesiRNA/miRNAorco-transfectDNA/siRNAorDNA/miRNAtovarietyofmammaliancells.
Size&content:
-GenMuteReagent,1.0mL,sufficientfor~2,000reactionsbasedontransfecting5.0pmolsiRNAormiRNAmimicsin24-wellplate.
-GenMuteTransfectionBuffer(5x),formulatedformaximaltransfectionefficiency,8.0mLtomake40mLworkingsolution.
Applications:
-SinglesiRNAtransfectionorDNA/siRNAco-transfectiontovarietyofmammaliancells.
-SinglemiRNA,miRNAmimicsorinhibitorstransfectionorDNA/miRNAorDNA/miRNAmimicsco-transfectiontovarietyofmammaliancells.
Storage:
Storeat4°CforGenMuteReagentandRTforGenMuteTransfectionBuffer(5x). Ifstoredproperly,theproductisstablefor12monthsorlonger.
Advantages:
-Excellentsilencingatlowconcentrationswithonly1.0nMsiRNA/miRNAmimics
-Minimizingnon-specificandofftargeteffectsinthecell
-Onetubereaction
-Bestforbroadmammaliancells
-Verylowcytotoxicity
-Veryaffordable
ComparisonsofSilencingEfficacyofGenMutesiRNA&DNATransfectionReagentwithBrandNameProducts
ExcellentsilencingofendogenouslyexpressedKIF11(alsoknownasEg5)inHEK293cellswith0.5µlofGenMutereagentand5.0pmolEg5siRNAperwellof24-wellplate.KIF11(alsoknownasEg5)encodesamotorproteinthatbelongstothekinesin-likeproteinfamilyinvolvedinchromosomepositioningandbipolarspindleformationduringcellmitosis.AreductioninKIF11levelscausesmitoticarrest.GenMutereagenteffectivelydeliversEg5siRNA(final10nM,rightpanel)toHEK293cellsatonly0.5µlperwellof24-wellplatevs.negativecontrol(final10nM.leftpanel).Comparedwithnegativecontrol(leftpanel),phenotypeof"rounded-up"293cellswerevisualized24hoursposttransfection(rightpanel)withaNikonmicroscope.
GenMuteTransfectionReagentknockeddownendogenouslaminA/CgeneexpressioninHelacells.AsiRNAtargetinglaminA/Cgene(rightpanel)andashamsiRNA(leftpanel)wereintroducedintoHelacells(final1.0nM)byGenMuteTransfectionReagent.LaminA/Cgenesilencingwasmonitored24hposttransfectionbyimmunofluorescence.LaminA/CwasprobedwithamousemonoclonallaminA/CspecificantibodyfollowedbyadditionofFITC-conjugatedanti-mouseantibodies.QuantitativeanalysisshowedthatlaminsiRNAat1.0nMdeliveredbyGenMuteTransfectionReagentknockeddown94%endogenouslyexpressedlaminA/CinHelacells.
DataSheet&Protocol
-AProtocolforsiRNATransfectionandDNA/siRNACo-Tranafection
-AProtocolformiRNAMimicsTransfectionandDNA/miRNACo-Transfection
-AProtocolforDNATransfectiontoMammalianCells
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其次要看下你选择单位的规模如何，做的比较好的，还是上海这边的，你可以看下基尔顿生物，原代细胞培养，动物造模，整体课题外包。
不建议你用MDCK细胞，非常难转染。
GFP发出绿色荧光的原理是Ca离子进入GFP的beta-barrel结构中引起的特定能级，因此只要这个结构仍然保持着，就可以发出荧光。
由于GFP的beta-barrel结构非常稳定，一些版本的GFP蛋白（如EGFP）甚至能抵抗94C的高温几分钟而不完全变性，因此想在溶液状态下去掉GFP的荧光是很难的，一般需要用光漂白法。
基于其非常稳定的结构，即便细胞被固定了，仍然会有一部分的GFP蛋白保持其构象而发出荧光。此时荧光可能较弱。在荧光显微镜下是有可能看得到的。
我刚开始做转染，悬浮细胞，分别做过表达和敲减，看了很多文献，大都没有提及转染后是用转染的这同一批细胞同时做pcr，wb，cck8，凋亡，细胞周期；还是说这次转染只做pcr或wb，再转染一次做cck8或细胞周期。剩下的功能试验均同前，转染一次做一次？我养的是悬浮细胞，转染后做cck8这些功能试验前需要离心换液吗？跪谢解答！
可以用移液器将细胞吸出来并高速离心，沉淀重悬于PBS中洗涤，接着就可以裂解提取蛋白了。可以用超声，酶解等等，裂解后离心收集上清。
其次要看下你选择单位的规模如何，上海这边的，你可以看下基尔顿生物，原代细胞培养，动物造模，整体课题外包。
实验室一直都是用日常型质粒抽提试剂盒，转染细胞没问题。
我觉得只要是注意以下2点就可以了：
1，注意大肠杆菌(Escherichia coli)本身的污染，收集菌体沉淀时防止菌液散落，经常用75%的乙醇擦拭手套。
2，最后洗脱时最好使用无内毒素的水，我们是用注射用水的。
无论是小提还是大提我们都是用的日常型的，并没有刻意用转染级的，因为转染量大，去内毒素的操作太麻烦，损失太大。
转染分2种，一种是瞬时转染，即转染后让细胞表达目的蛋白后即提取蛋白，提一次蛋白，转染一次，这种方式一般不传代；
另一种转染为稳定转染，转染后加入一定选择压力进行筛选，没有转染的细胞不能存活，只留下转染的细胞，这种情况下可以筛选单个转染细胞，构建稳定表达某一特定蛋白或基因的细胞系。
