The pHEK293 Ultra Expression Vectors are plasmids for transient overexpression of a protein of interest in human HEK 293 cells. Protein expression using these vectors can be up to 10 times higher than what is obtained from vectors with conventional cytomegalovirus (CMV)-derived promoters. Prior to purchasing these products, all customers must complete a purchaser"s agreement to submit with the order.
High protein expression is accomplished using the HIV-1 TAR-Tat system.
The pHEK293 Ultra Expression Vectors are plasmids for transient overexpression of a protein of interest in human HEK 293 cells. Protein expression using these vectors can be up to 10 times higher than what is obtained from vectors with conventional cytomegalovirus (CMV)-derived promoters. Prior to purchasing these products, all customers must complete a purchaser"s agreement to submit with the order.
High protein expression is accomplished using the HIV-1 TAR-Tat system. The TAR (transactivation response) element is an RNA sequence derived from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) that forms a stem-loop structure at the 5’ end of HIV-1 RNAs. Tat is an RNA-binding protein that activates transcription by binding to the TAR and promoting transcriptional elongation.
The pHEK293 Ultra Expression Vectors exploit this transcriptional activation mechanism; the TAR sequence is present in the 5" untranslated region of the target gene, and a Tat expression cassette is included either on the same vector (Cat. # 3390) or on a separate plasmid (Cat. # 3392). This system allows efficient expression of Tat protein, thereby greatly increasing the amount of target protein that is expressed. Since the TAR sequence is located in the untranslated region of the target gene, it does not affect the amino acid sequence of the expressed target protein.
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目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡；
转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害；
细胞贴壁转染之后没有正常换液。
建议：考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统；摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试义翘转染试剂sinofection；对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考虑添加一些血清来帮助细胞恢复健康。
以上所有分析、建议的前提是，细胞培养、无菌操作等等都没有问题。祝顺利，加油~
各位版友求助，
我使用Hek293构建转染模型，瞬转5质粒，用lipo2000做转染体系。
转染48h，发现荧光较强的细胞都在爬片的边缘，比例十分少。是因为我添加试剂的手法不对吗。
同时也发现加入转染体系后细胞状态特别差。想问一下用lipo2000时可以用无双抗的10%FBSDMEM吗。我转染前6h现在用的是纯DMEM，不含FBS。
请各位大神帮忙
我刚开始做转染，悬浮细胞，分别做过表达和敲减，看了很多文献，大都没有提及转染后是用转染的这同一批细胞同时做pcr，wb，cck8，凋亡，细胞周期；还是说这次转染只做pcr或wb，再转染一次做cck8或细胞周期。剩下的功能试验均同前，转染一次做一次？我养的是悬浮细胞，转染后做cck8这些功能试验前需要离心换液吗？跪谢解答！
DXY721认为：
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大，主要差别在于转染后的筛选，当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单，问题是能不能转的进去的，转染率能有多少，转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染，说明书上都有具体的操作过程，将脂质体和目的基因按比例混合，然后加到细胞悬液里就OK了，说的简单，实际上还是有一些细节要注意的，比如脂质体和目的基因混合的比例，转染的细胞数，细胞的代数，细胞的状态，有的还要求在转染的前一天传代一次，不过不要怕，这些在脂质体说明书上都有明确的说明，按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为：
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法，目前为止，悬浮细胞转染的最好方法还是电转，我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的，使用条件是电压250V，电容975uF，效果不错，不妨一用。
实验室一直都是用日常型质粒抽提试剂盒，转染细胞没问题。
我觉得只要是注意以下2点就可以了：
1，注意大肠杆菌(Escherichia coli)本身的污染，收集菌体沉淀时防止菌液散落，经常用75%的乙醇擦拭手套。
2，最后洗脱时最好使用无内毒素的水，我们是用注射用水的。
无论是小提还是大提我们都是用的日常型的，并没有刻意用转染级的，因为转染量大，去内毒素的操作太麻烦，损失太大。
做的比较好的，一般都是上海地区的，你可以看下基尔顿生物。
本人研究生
