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제품특징
□ 특징
● 목적 단백질을 고발현하는 세포를 항생제나 형광을 이용해 빠르게 선별
● Bicistronic expression으로 stable clone을 빠르고, 정확하게 선별
pIRES Bicistronic Expression Vector는 목적 단백질을 발현하는 clone을 빠르고 효과적으로 선별할 수 있게 한다. 이 vector는 하나의 promoter로 목적 유전자와 선별 마커 (Figure 1) 또는 Living Colors Fluorescent Protein (Figure 2) 모두를 발현할 수 있는 cassette를 가지고 있다. 그러므로 실질적으로 마커를 발현하는 세포는 목적 유전자를 발현한다. 이런 vector를 이용하면 최소한의 선별과정으로 목적 단백질을 고발현하는 clone을 선별할수 있다.
□ IRES Bicistronic Expression
뇌심근염바이러스 (encephalomyocarditis virus (ECMV))의 IRES (internal ribosome entry site)는 하나의 mRNA로부터 2 개의 ORF (open reading frame)를 번역하도록 한다 (1, 2). Ribosome은 bicistronic mRNA의 5＇-말단에서부터 목적 유전자를 번역하며, 선별 마커 또는 형광 reporter를 번역하기 위하여 IRES에 결합한다. 모든 pIRES Antibiotic Selection Vector는 cloning된 유전자의 번역 개시 효율에 비하여 상대적으로 선별 마커의 번역 개시 효율을 감소시키는 부분적으로 결함을 가진 IRES를 포함한다. 이것은 목적 단백질을 고발현하는 세포를 우선적으로 선별할 수 있게 한다 (3).
□ Living Colors pIRES2 Vectors와 어울리는 유전자 발현
Living Colors pIRES2 Vector는 완전히 활성화된 IRES 서열을 포함하고 있어 형광단백질을 동등하게 고발현시킬 수 있다. 마커는 융합단백질이기 보다는 개별적인 단백질이기 때문에 목적 단백질의 생물학적 활성에 대한 위험이 거의 없다. pIRES2 vector는 일시적으로 transfection된 세포의 농축이나 형광 강도를 통해 목적 유전자의 발현 수준을 관찰 하는데 유용한다.pEXP-Lib vector는 포유류 세포에서 cDNA library를 발현시키는데 사용할 수 있다. 2 종의 retrovirus용 IRES vector는 transfection하기 힘든 세포에 목적유전자와 형광단백질을 도입하는데 유용하다.
Figure 1. Map of the pIRES Selection Vectors.
Figure 2. Map of the Fluorescent pIRES2 Bicistronic Expression Vectors.
Figure 3. Schematic diagram of bicistronic mRNA translation. The internal ribosome entry site (IRES) permits a protein of interest and either an antibiotic resistance marker or fluorescent protein to be translated from the same mRNA. IVS = synthetic intron.
□ Components & Storage Conditions
각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.
□ References
1. Jackson, R. J. et al. (1990) Trends Biochem. Sci. 15:477-483.2. Jang, S. K. et al. (1988) J. Virol. 62:2636-2643.3. Rees, S. et al. (1996) Biotechniques 20:102-110.
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目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡；
转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害；
细胞贴壁转染之后没有正常换液。
建议：考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统；摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试义翘转染试剂sinofection；对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考虑添加一些血清来帮助细胞恢复健康。
以上所有分析、建议的前提是，细胞培养、无菌操作等等都没有问题。祝顺利，加油~
不建议你用MDCK细胞，非常难转染。
GFP发出绿色荧光的原理是Ca离子进入GFP的beta-barrel结构中引起的特定能级，因此只要这个结构仍然保持着，就可以发出荧光。
由于GFP的beta-barrel结构非常稳定，一些版本的GFP蛋白（如EGFP）甚至能抵抗94C的高温几分钟而不完全变性，因此想在溶液状态下去掉GFP的荧光是很难的，一般需要用光漂白法。
基于其非常稳定的结构，即便细胞被固定了，仍然会有一部分的GFP蛋白保持其构象而发出荧光。此时荧光可能较弱。在荧光显微镜下是有可能看得到的。
DXY721认为：
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大，主要差别在于转染后的筛选，当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单，问题是能不能转的进去的，转染率能有多少，转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染，说明书上都有具体的操作过程，将脂质体和目的基因按比例混合，然后加到细胞悬液里就OK了，说的简单，实际上还是有一些细节要注意的，比如脂质体和目的基因混合的比例，转染的细胞数，细胞的代数，细胞的状态，有的还要求在转染的前一天传代一次，不过不要怕，这些在脂质体说明书上都有明确的说明，按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为：
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法，目前为止，悬浮细胞转染的最好方法还是电转，我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的，使用条件是电压250V，电容975uF，效果不错，不妨一用。
脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。
阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体 其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。
转染分2种，一种是瞬时转染，即转染后让细胞表达目的蛋白后即提取蛋白，提一次蛋白，转染一次，这种方式一般不传代；
另一种转染为稳定转染，转染后加入一定选择压力进行筛选，没有转染的细胞不能存活，只留下转染的细胞，这种情况下可以筛选单个转染细胞，构建稳定表达某一特定蛋白或基因的细胞系。
