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제품특징
□ 특징
● 목적 단백질을 고발현하는 세포를 항생제나 형광을 이용해 빠르게 선별
● Bicistronic expression으로 stable clone을 빠르고, 정확하게 선별
pIRES Bicistronic Expression Vector는 목적 단백질을 발현하는 clone을 빠르고 효과적으로 선별할 수 있게 한다. 이 vector는 하나의 promoter로 목적 유전자와 선별 마커 (Figure 1) 또는 Living Colors Fluorescent Protein (Figure 2) 모두를 발현할 수 있는 cassette를 가지고 있다. 그러므로 실질적으로 마커를 발현하는 세포는 목적 유전자를 발현한다. 이런 vector를 이용하면 최소한의 선별과정으로 목적 단백질을 고발현하는 clone을 선별할수 있다.
□ IRES Bicistronic Expression
뇌심근염바이러스 (encephalomyocarditis virus (ECMV))의 IRES (internal ribosome entry site)는 하나의 mRNA로부터 2 개의 ORF (open reading frame)를 번역하도록 한다 (1, 2). Ribosome은 bicistronic mRNA의 5＇-말단에서부터 목적 유전자를 번역하며, 선별 마커 또는 형광 reporter를 번역하기 위하여 IRES에 결합한다. 모든 pIRES Antibiotic Selection Vector는 cloning된 유전자의 번역 개시 효율에 비하여 상대적으로 선별 마커의 번역 개시 효율을 감소시키는 부분적으로 결함을 가진 IRES를 포함한다. 이것은 목적 단백질을 고발현하는 세포를 우선적으로 선별할 수 있게 한다 (3).
□ Living Colors pIRES2 Vectors와 어울리는 유전자 발현
Living Colors pIRES2 Vector는 완전히 활성화된 IRES 서열을 포함하고 있어 형광단백질을 동등하게 고발현시킬 수 있다. 마커는 융합단백질이기 보다는 개별적인 단백질이기 때문에 목적 단백질의 생물학적 활성에 대한 위험이 거의 없다. pIRES2 vector는 일시적으로 transfection된 세포의 농축이나 형광 강도를 통해 목적 유전자의 발현 수준을 관찰 하는데 유용한다.pEXP-Lib vector는 포유류 세포에서 cDNA library를 발현시키는데 사용할 수 있다. 2 종의 retrovirus용 IRES vector는 transfection하기 힘든 세포에 목적유전자와 형광단백질을 도입하는데 유용하다.
Figure 1. Map of the pIRES Selection Vectors.
Figure 2. Map of the Fluorescent pIRES2 Bicistronic Expression Vectors.
Figure 3. Schematic diagram of bicistronic mRNA translation. The internal ribosome entry site (IRES) permits a protein of interest and either an antibiotic resistance marker or fluorescent protein to be translated from the same mRNA. IVS = synthetic intron.
□ Components & Storage Conditions
각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.
□ References
1. Jackson, R. J. et al. (1990) Trends Biochem. Sci. 15:477-483.2. Jang, S. K. et al. (1988) J. Virol. 62:2636-2643.3. Rees, S. et al. (1996) Biotechniques 20:102-110.
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DXY721认为：
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大，主要差别在于转染后的筛选，当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单，问题是能不能转的进去的，转染率能有多少，转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染，说明书上都有具体的操作过程，将脂质体和目的基因按比例混合，然后加到细胞悬液里就OK了，说的简单，实际上还是有一些细节要注意的，比如脂质体和目的基因混合的比例，转染的细胞数，细胞的代数，细胞的状态，有的还要求在转染的前一天传代一次，不过不要怕，这些在脂质体说明书上都有明确的说明，按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为：
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法，目前为止，悬浮细胞转染的最好方法还是电转，我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的，使用条件是电压250V，电容975uF，效果不错，不妨一用。
“转化”是指含外源基因的重组质粒（载体）将外源基因直接导入原核细胞（如细菌）；
“转导”指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞；
“转染”指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞；
“感染”在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程。
在使用这4 个名词时， 应仔细分析基因转移实验的四要素——转移物、载体、介导方法、受体细胞类型，而正确区 分载体和受体细胞类型是辨析的关键点。当载体是重组质粒时，如受体细胞是原核细胞应使 用“转化”，如受体细胞是真核细胞则使用“转染”；当载体是重组病毒时，如强调转移物进 入受体细胞应使用“转导”，如强调重组病毒载体进入受体细胞的过程则使用“感染”。
我刚开始做转染，悬浮细胞，分别做过表达和敲减，看了很多文献，大都没有提及转染后是用转染的这同一批细胞同时做pcr，wb，cck8，凋亡，细胞周期；还是说这次转染只做pcr或wb，再转染一次做cck8或细胞周期。剩下的功能试验均同前，转染一次做一次？我养的是悬浮细胞，转染后做cck8这些功能试验前需要离心换液吗？跪谢解答！
实验室一直都是用日常型质粒抽提试剂盒，转染细胞没问题。
我觉得只要是注意以下2点就可以了：
1，注意大肠杆菌(Escherichia coli)本身的污染，收集菌体沉淀时防止菌液散落，经常用75%的乙醇擦拭手套。
2，最后洗脱时最好使用无内毒素的水，我们是用注射用水的。
无论是小提还是大提我们都是用的日常型的，并没有刻意用转染级的，因为转染量大，去内毒素的操作太麻烦，损失太大。
本人研究生
悬浮细胞的转染方法：（以下内容转自生物帮资讯）
DXY721认为：
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大，主要差别在于转染后的筛选，当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单，问题是能不能转的进去的，转染率能有多少，转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染，说明书上都有具体的操作过程，将脂质体和目的基因按比例混合，然后加到细胞悬液里就OK了，说的简单，实际上还是有一些细节要注意的，比如脂质体和目的基因混合的比例，转染的细胞数，细胞的代数，细胞的状态，有的还要求在转染的前一天传代一次，不过不要怕，这些在脂质体说明书上都有明确的说明，按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为：
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法，目前为止，悬浮细胞转染的最好方法还是电转，我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的，使用条件是电压250V，电容975uF，效果不错，不妨一用。
DXY721认为：
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大，主要差别在于转染后的筛选，当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单，问题是能不能转的进去的，转染率能有多少，转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染，说明书上都有具体的操作过程，将脂质体和目的基因按比例混合，然后加到细胞悬液里就OK了，说的简单，实际上还是有一些细节要注意的，比如脂质体和目的基因混合的比例，转染的细胞数，细胞的代数，细胞的状态，有的还要求在转染的前一天传代一次，不过不要怕，这些在脂质体说明书上都有明确的说明，按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为：
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法，目前为止，悬浮细胞转染的最好方法还是电转，我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的，使用条件是电压250V，电容975uF，效果不错，不妨一用。
