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제품특징
□ 특징
● 목적 단백질을 고발현하는 세포를 항생제나 형광을 이용해 빠르게 선별
● Bicistronic expression으로 stable clone을 빠르고, 정확하게 선별
pIRES Bicistronic Expression Vector는 목적 단백질을 발현하는 clone을 빠르고 효과적으로 선별할 수 있게 한다. 이 vector는 하나의 promoter로 목적 유전자와 선별 마커 (Figure 1) 또는 Living Colors Fluorescent Protein (Figure 2) 모두를 발현할 수 있는 cassette를 가지고 있다. 그러므로 실질적으로 마커를 발현하는 세포는 목적 유전자를 발현한다. 이런 vector를 이용하면 최소한의 선별과정으로 목적 단백질을 고발현하는 clone을 선별할수 있다.
□ IRES Bicistronic Expression
뇌심근염바이러스 (encephalomyocarditis virus (ECMV))의 IRES (internal ribosome entry site)는 하나의 mRNA로부터 2 개의 ORF (open reading frame)를 번역하도록 한다 (1, 2). Ribosome은 bicistronic mRNA의 5'-말단에서부터 목적 유전자를 번역하며, 선별 마커 또는 형광 reporter를 번역하기 위하여 IRES에 결합한다. 모든 pIRES Antibiotic Selection Vector는 cloning된 유전자의 번역 개시 효율에 비하여 상대적으로 선별 마커의 번역 개시 효율을 감소시키는 부분적으로 결함을 가진 IRES를 포함한다. 이것은 목적 단백질을 고발현하는 세포를 우선적으로 선별할 수 있게 한다 (3).
□ Living Colors pIRES2 Vectors와 어울리는 유전자 발현
Living Colors pIRES2 Vector는 완전히 활성화된 IRES 서열을 포함하고 있어 형광단백질을 동등하게 고발현시킬 수 있다. 마커는 융합단백질이기 보다는 개별적인 단백질이기 때문에 목적 단백질의 생물학적 활성에 대한 위험이 거의 없다. pIRES2 vector는 일시적으로 transfection된 세포의 농축이나 형광 강도를 통해 목적 유전자의 발현 수준을 관찰 하는데 유용한다.pEXP-Lib vector는 포유류 세포에서 cDNA library를 발현시키는데 사용할 수 있다. 2 종의 retrovirus용 IRES vector는 transfection하기 힘든 세포에 목적유전자와 형광단백질을 도입하는데 유용하다.
Figure 1. Map of the pIRES Selection Vectors.
Figure 2. Map of the Fluorescent pIRES2 Bicistronic Expression Vectors.
Figure 3. Schematic diagram of bicistronic mRNA translation. The internal ribosome entry site (IRES) permits a protein of interest and either an antibiotic resistance marker or fluorescent protein to be translated from the same mRNA. IVS = synthetic intron.
□ Components & Storage Conditions
각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.
□ References
1. Jackson, R. J. et al. (1990) Trends Biochem. Sci. 15:477-483.2. Jang, S. K. et al. (1988) J. Virol. 62:2636-2643.3. Rees, S. et al. (1996) Biotechniques 20:102-110.
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DXY721认为:
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大,主要差别在于转染后的筛选,当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单,问题是能不能转的进去的,转染率能有多少,转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染,说明书上都有具体的操作过程,将脂质体和目的基因按比例混合,然后加到细胞悬液里就OK了,说的简单,实际上还是有一些细节要注意的,比如脂质体和目的基因混合的比例,转染的细胞数,细胞的代数,细胞的状态,有的还要求在转染的前一天传代一次,不过不要怕,这些在脂质体说明书上都有明确的说明,按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为:
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理,先形成脂质体-DNA复合物,散布在细胞周围,然后通过细胞的内吞作用,将目的基因导入细胞内,而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍,所以,脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法,目前为止,悬浮细胞转染的最好方法还是电转,我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的,使用条件是电压250V,电容975uF,效果不错,不妨一用。
本人研究生
我转的是7901、7901/DDP两种细胞,前者7901细胞很容易就转上,并且转后,状态良好,可是7901/DDP一转就死,我用的是吉玛慢病毒,转24小时后换液,刚开始一两天,没有异常,但后来细胞慢慢就死了,并且不是漂浮的,很多是贴着壁死,像是瓦解了一样
这是未转时细胞的样子
这是细胞转后,死亡的样子
并且即使是有些细胞未死,细胞后来也变得很脏,感觉有很破碎的细胞碎片
本人实验小白,**园子里大神指点,急,实在不知道怎么回事
GFP发出绿色荧光的原理是Ca离子进入GFP的beta-barrel结构中引起的特定能级,因此只要这个结构仍然保持着,就可以发出荧光。
由于GFP的beta-barrel结构非常稳定,一些版本的GFP蛋白(如EGFP)甚至能抵抗94C的高温几分钟而不完全变性,因此想在溶液状态下去掉GFP的荧光是很难的,一般需要用光漂白法。
基于其非常稳定的结构,即便细胞被固定了,仍然会有一部分的GFP蛋白保持其构象而发出荧光。此时荧光可能较弱。在荧光显微镜下是有可能看得到的。
影响转染试验的因素:
1转染试剂跟细胞系不匹配
转染试剂跟细胞系也是讲究配合默契的,使用同一种试剂,不同细胞系转染效率通常不同。但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然,最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。
2细胞状态变化
因为有些细胞系是不稳定的,可能随着培养时间的改变,培养条件的不同,不同的选择压力,可能引起不同的克隆选择。因此就算是同一个细胞系,在不同条件下转染能力的差异可能会
很大
(1)转染试剂与细胞不匹配
细胞转染最适合的不是原代细胞,也不是传代很多次的细胞。这是因为细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到对数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染。
(2)把握时机
没错!转染也有适当的时机,相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言,细胞都在转染当天或前一天种板。
同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态,如癌细胞数量过多,互相叠加,营养物质耗竭,代谢废物积聚,转染率低下也是很正常的!
因此,一定要在最适细胞密度时转染,才能获得较高的转染率。不同的转染试剂,要求转染时的最适细胞密度各不相同,即使同一种试剂,也会因不同的细胞类型或应用而异。
(3)微生物来捣乱
培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。各种污染都会导致产生错误的结果。
(4)交叉污染
如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞,很同意发生“细胞串门”的现象,造成交叉污染。
3转染方法
不同转染试剂有不同的转染方法,但大多大同小异。转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法,但也要注意,因不同实验室培养的细胞性质不同,质粒定量差异,操作手法上的差异等,其转染效果可能不同,应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。
(1)血清
转染后未及时加入血清,会导致细胞大量死亡。一般要在转染后的4-6小时换液且换为有血清的培养基。也可以在原来的无血清培养基里面滴加血清。这个时候,最好不要换液,不要打扰细胞,让它安安静静地休息。但是也不能过早加入血清。过早的话,会引起未转染的细胞疯狂生长。那么,什么是最佳时机呢?在20%的细胞变圆的时候,就是加血清的最佳时机。
不过要特别注意:血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响细胞生长,因此也会影响转染效率。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。
(2)DNA质量
DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术(如脂质体等)基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
4载体构建
转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)也影响转染结果。因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。
所以转染用的质粒首先要保证数量,一般为2μg以上。质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质,也会影响转染效率。这个时候,就应该对质粒进行纯化和浓缩。
以上就是细胞转染率低的主要原因了,在实验过程中有没有遇到什么棘手的问题呢,欢迎留言讨论
做的比较好的,一般都是上海地区的,你可以看下基尔顿生物。