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제품특징
□ 상세정보
TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit는 식물조직으로부터 genomic DNA를 정제하는 제품이다. 본 제품은 두 가지의 프로토콜 (일반적인 식물조직에서 genomic DNA를 추출하는 방법과 polysaccharide나 polyphenol을 다량 함유한 식물조직으로부터 genomic DNA를 추출하는 방법)을 적용하고 있다. 본 제품을 사용하면 액체질소를 이용한 식물조직grinding 이후, 40분 내에 고순도의genomic DNA를 추출 가능하다. (50 - 500 mg의 식물 조직으로 부터 1 - 10ug의 고순도 genomic DNA를 얻을 수 있다.) 정제한 genomic DNA는PCR, Southern blotting, RAPD, AFLP, RFLP와 같은 다양한 실험에 적용가능하다.
□ Flowchart
□ 내용
▶ Part I
50X DTT Buffer | 700ul |
RNaseA | 500ul |
▶ Part II
Buffer HS I*1,3 | 28 ml |
Buffer HS II*1 | 28 ml |
Buffer KAC | 1.8 ml x 2 |
Buffer GB*1 | 28 ml |
Buffer WA*1 | 28 ml |
Buffer WB*2 | 24 ml |
Elution Buffer | 14 ml |
Spin Columns | 50 |
Collection tubes | 50 |
*1: Contains strong denaturant. Be carefulto avoid contacting with skin and eyes.In the case of such contact,
washimmediately with plenty water and seek medical advice. *2: Before using the kit, add 56 ml of 100%ethanol. Mix well. *3: When Buffer HS I form precipitate bystorage bellow room temperature (15 - 25℃ ), redissolve the precipitate
by incubating at 37℃ before used.※ 이하 시약은 별도 준비가 필요합니다.1. 100% ethanol2. Sterile distilled water
□ 보관 및 운송
1. Part I can bestored at -20℃, and Part II can be stored at room temperature (15 - 25℃ ). 2. Part I can be shipped at -20℃, and Part II can beshipped at room temperature (15 - 25℃ ).
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目标蛋白对细胞有毒性,导致细胞死亡;
转染试剂以及DNA用量信息需要优化,否则对细胞具有伤害;
细胞贴壁转染之后没有正常换液。
建议:考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统;摸索转染试剂以及DNA用量信息,如果转染试剂毒性太大,可以考虑尝试义翘转染试剂sinofection;对转染后的细胞进行换液处理,如果细胞状态感觉不够理想,可以考虑添加一些血清来帮助细胞恢复健康。
以上所有分析、建议的前提是,细胞培养、无菌操作等等都没有问题。祝顺利,加油~
不建议你用MDCK细胞,非常难转染。
GFP发出绿色荧光的原理是Ca离子进入GFP的beta-barrel结构中引起的特定能级,因此只要这个结构仍然保持着,就可以发出荧光。
由于GFP的beta-barrel结构非常稳定,一些版本的GFP蛋白(如EGFP)甚至能抵抗94C的高温几分钟而不完全变性,因此想在溶液状态下去掉GFP的荧光是很难的,一般需要用光漂白法。
基于其非常稳定的结构,即便细胞被固定了,仍然会有一部分的GFP蛋白保持其构象而发出荧光。此时荧光可能较弱。在荧光显微镜下是有可能看得到的。
DXY721认为:
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大,主要差别在于转染后的筛选,当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单,问题是能不能转的进去的,转染率能有多少,转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染,说明书上都有具体的操作过程,将脂质体和目的基因按比例混合,然后加到细胞悬液里就OK了,说的简单,实际上还是有一些细节要注意的,比如脂质体和目的基因混合的比例,转染的细胞数,细胞的代数,细胞的状态,有的还要求在转染的前一天传代一次,不过不要怕,这些在脂质体说明书上都有明确的说明,按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为:
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理,先形成脂质体-DNA复合物,散布在细胞周围,然后通过细胞的内吞作用,将目的基因导入细胞内,而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍,所以,脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法,目前为止,悬浮细胞转染的最好方法还是电转,我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的,使用条件是电压250V,电容975uF,效果不错,不妨一用。
脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层,又称为人工生物膜。
阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内,形成DNA一脂复合体,也能被表面带负电荷的细胞膜吸附,再通过膜的融合或细胞的内吞作用,偶尔也通过直接渗透作用,DNA传递进入细胞,形成包涵体或进入溶酶体 其中一小部分DNA能从包涵体内释放,并进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。
转染分2种,一种是瞬时转染,即转染后让细胞表达目的蛋白后即提取蛋白,提一次蛋白,转染一次,这种方式一般不传代;
另一种转染为稳定转染,转染后加入一定选择压力进行筛选,没有转染的细胞不能存活,只留下转染的细胞,这种情况下可以筛选单个转染细胞,构建稳定表达某一特定蛋白或基因的细胞系。

