为了纯化细胞蛋白质，采用有效的方法进行细胞破碎和固液分离是必要的。它是全过程的第一步，通常是将处于细胞不同位置的待纯化蛋白释放出来，溶入已知成分的溶液内。该步骤是目的蛋白初级分离纯化阶段的重要环节，它直接影响产物的回收率，也可能影响产物的纯度。来源：《蛋白质技术手册》
0 收藏 0 阅读通过固体剪切力破碎组织和细胞，释放蛋白进入溶液。市售的匀浆器主要有四类，刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器和用于规模生产的髙压匀浆器。玻璃匀浆器的匀浆头（杵）有玻璃制的，也有特夫隆制的，既可以手动也可以电动。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，是实验室首先考虑的方法之一。
1. 用组织剪或芋术刀迅速将清洗的组织分离成适宜的小块，如 1 cm3；
2. 每体积湿重组织通常加 3～5 倍体积预冷的匀浆缓冲液至匀浆容器内；
3. 制备匀浆 ：
3.1 电力驱动的玻璃匀浆器以 500～1500 r／min 的速度，匀浆 3～6 次，每次 5～10 s 。
3.2 手动玻璃匀浆器匀浆 10 ～20 次。
3.3 刀片式组织破碎匀浆器和内切式组织匀浆器以 1000～3000 r／min 的速度，高速匀浆 3 次 ，每次 20～30 s，次间暂停几秒。
1. 玻璃匀浆器杵和臼之间的空隙应为 0.35～0.70 mm。 电动玻璃匀浆器常用于匀桨肝、心、肌肉等软组织的匀浆；手动玻璃匀浆器常用于培养细胞和脑组织等的匀浆。
2. 匀浆过程应注意维持低温。玻璃匀浆器可外置冰水浴，其他匀浆容器可预冷或在冷室内匀浆。
3. 匀浆时所霈匀浆缓冲液的体积在不同条件下可有很大差别，有时甚至可为湿重组织体积的 9～10 倍。
4. 匀浆的效果可以用相差显微镜观察组织细胞状况评估，也可定量单位湿重组织释放的蛋白质含量监控。
输入高能超声波可以破碎细胞，其机理可能与强声波作用溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解。超声破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。
1. 清洗后的组织用搅切机切碎成小块，混悬在至少两倍体积的缓冲液内；洗去培养液的细胞（细菌混悬在至少两倍体积的缓冲液内；
2. 将超声探头没入混悬液内，进行超声破碎。一般总超声时间约分为几个周期，如 4 × 30 s， 周期之间让样品在冰浴中冷却。
1. 超声破碎常用于多种细菌和脑组织匀浆。根据具体情况可以适当延长破碎时间，一般不宜超过 10 min，但最多处理 1 g 细菌或组织。
2. 用相差显微镜检査细胞破碎的效率。
3. 超声破碎需提醒注意的一点是在整个过程中探头要保持低于混悬液表面。
细胞悬液从高压室的环状隙高速喷射到静止的撞击环上，被迫改变方向经出口管流出。此过程中细胞经历了高速造成的剪切、碰撞及高压到常压的变化，从而破碎释放内含物。增加压力或增加破碎次数都能提高破碎效率，但压力增加到一定程度零部件磨损较大。通常撞击环较易磨损应定期更换。为防止污染，使用前后高压室至出口管需彻底清洁。
1. 用裂解缓冲液混悬清洗过的细胞。通常细胞湿重（g ）与缓冲液体积（ml）之比的范围是 1/1 到 1/4；
2. 加样品液进入高压室，并提升压力至预定值（一般 0.55×108～1.38×108 Pa）；
3. 维持上述压力，调整出口流速为每分钟 2～3 ml（约每秒 1 滴）。
1. 该法常用来裂解细菌和酵母。
2. 适用于中等体积（10～30 ml）的样品，体积太大或太小均不适宜。
3. 为获得样品最佳破碎效果，样品可以第二次甚至第三次通过高压匀浆。
4. 温度敏感物质有必要低温操作。多次实施时，每次样品要冷。
研磨是破碎单一细胞的有效措施。借助研磨中磨料和细胞间的剪切及碰撞作用破碎细胞。常 用的磨料为沙子、氧化铝在研钵内样品与磨料被研磨成厚糊状。一次破碎的细胞量湿重可达 30 g。
1. 加 20 g 淸洗过的细胞入预冷的研钵内；
2. 准备 40 g 石英沙或氧化 铝；
3. 在研磨细胞的过程中逐步加入石英沙或氧化铝，即边研磨边加入。加完磨料再继续研磨几分钟；
4. 用 60 ml 缓冲液混悬细胞糊，离心除去细胞碎片和磨料。
1. 此法主要用于细菌、酵母和一些植物组织。研磨操作一般不超过 15 min。
2. 石英沙或氧化铝用前做清洁处理。
3. 研磨时产生劈啪声可能是效果不错的好兆头。
该法应视为研磨法的扩展。它用玻璃珠替代磨料。小量样品（湿重不超过 3 g）可在试管内进行，大量样品需使用特制的高速珠磨机。
1. 0.1～3 g 湿重细胞混悬在等体积缓冲液内。容器建议选用结实的聚乙烯试管；
2. 每克湿重细胞加入 1～3 g 预冷的玻璃珠；
3. 用混旋搅拌器最大强度混旋 3～5 次，每次 1 min， 两次之间置冰上冷却 1 min。
1. 本法最常用来破碎酵母。
2. 玻璃珠直径 500 um，用前如下处理：浓盐酸洗后，双蒸水洗至中性，烘干。用前预冷。
3. 混旋时易漏出，宜用有密封圈的螺旋盖关紧试管或用石蜡膜封好。
酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。因此利用此方法处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶。常用的有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、壳多糖酶等、细菌主要用溶菌酶处理，酵母需要用几种酶进行复合处理。使用溶酶系统时要注意控制温度、酸碱度、酶用量、先后次序及时间。这里仅以溶菌酶处理大肠杆菌为例，介绍具体体方法如下。
1. 混悬洗过的大肠杆菌于 TE 缓冲液内，每克细菌需 3 ml 缓冲液。调整温度至 20℃～37℃；
2. 每 5 ml 混悬液加入1 mg 溶菌酶，可以从新配制 10 mg／ml 的母液吸取或直接用酶的冻干粉；
3. 在 20℃～37℃ 温育 10～20 min，同时轻轻摇动。
1. 增加溶菌酶的浓度，如高达 10 mg／ml，能更快的溶解细菌，用更高的浓度甚至在 4℃ 作用 5 min 即可获得满意的溶解。
2. 虽然酶溶法有选择性释放产物、核酸泄出量少、细胞外形完整等优点，但它也存在明显不足：如酶价格高、通用性差、有时存在产物抑制。
有些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂（SDS、Triton X-100）、金属整合剂（EDTA） 、变性剂（盐酸胍、脲）等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择地渗透出来。这种处理方式就是化学渗透法。本文仅以表面活性剂 Triton X-100 为例简要介绍如下。
1. 用缓冲盐液（TBS：10 mmol／L pH7.5 Tris-HCl，150 mmol／L NaCl） 4℃：洗细胞几次；
2. 离心除去缓冲盐液，在 含 0.1 ％～0.3 ％ Triton X-100 的缓冲盐液（TBS） 中混悬细胞（107～ 108 细胞／ml 或总蛋白 3 ～ 4 mg／ml）；
3. 混旋或颠倒试管几次后，冰浴中孵育 10 ～60 min。
1. 低浓度表面活性剂处理。如能充分溶解细胞，则它是很温和的方法。
2. 若目的蛋白不稳定，冰浴中孵育时间可以减少甚至取消；裂解液内加入 0.2 倍体积 50％ 甘油也可以稳定目的蛋白。
3. Triton X-100 以外的表面活性剂也可以用。
4. 此法主要用于溶解培养的动物细胞。
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