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刚入实验坑的新人一枚，有关凋亡和增殖的检测方法看来看去有好多啊，我想问下大神们目前用的最多的有关细胞凋亡和增殖的检测方法分别是什么？哪些相对更加精确一些，而哪些只是粗略的看一下啊？？
细胞分裂间期分为G1期S期和G2期 G1期的特点：G1期是从上次细胞增殖周期完成以后开始的。G1期是一个生长期。在这一时期主要进行RNA和蛋白质的生物合成，并且为下阶段S期的DNA合成做准备。如合成各种与DNA复制有关的酶，线粒体、核糖体等都增多了
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
如题。以及下面问题：
要检测转基因小鼠（不知道）和正常鼠细胞免疫的改变（T细胞）需要做那些实验？
细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
解析：细胞增殖是重要的细胞生命特征。
由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,Mtb）引起的结核病是一种古老的慢性传染病，并且至今仍是全球死亡人数最多的单一传染病。据世界卫生组织（WHO）报道：2015年全球有1040万新发结核病患者，有180万人死于结核病。Mtb是一种胞内病原菌，可分泌多种效应蛋白至宿主细胞中，进而干扰细胞信号通路和生物学功能，最终促进病原菌在宿主细胞中的存活并导致宿主细胞病变。中国科学院微生物研究所刘翠华课题组长期致力于研究Mtb等重要病原菌与宿主相互作用的分子机制，近年来先后在NatureImmunology,TheJournalofImmunology等杂志发表系列研究工作，发现了Mtb通过分泌一系列效应蛋白调控宿主细胞功能进而逃逸宿主固有免疫清除的新机制，并揭示了病原菌与宿主间相互博弈的动态过程及分子机制，为抗结核药物研发提供了新思路和特异靶点。
近年来，越来越多的研究表明病原微生物（包括多种病毒和细菌等）感染引起的慢性炎症可增加肿瘤发生发展的危险性，有关感染相关的慢性炎症诱发肿瘤的分子机制研究已成为当前生物医学领域的热点之一。然而，Mtb导致的慢性感染与肺癌的相关性至今尚无定论，关于Mtb效应蛋白在肿瘤发生发展中的分子调控机制更是知之甚少。刘翠华课题组之前的研究表明：Mtb效应蛋白PtpA（一种真核样酪氨酸磷酸酶）可被分泌至宿主细胞中结合泛素分子并被后者激活，进而去磷酸化宿主的p-JNK和p-p38并抑制JNK/p38信号通路的激活；同时PtpA还能以磷酸酶活性非依赖性的方式抑制NF-κB信号通路的激活（NatureImmunology,2015）。进一步的研究发现PtpA的宿主互作蛋白TRIM27（一种泛素连接酶）可作为宿主限制因子抑制分枝杆菌在巨噬细胞内的存活，而PtpA则可通过结合TRIM27蛋白的RING结构域而拮抗TRIM27介导的抗病原菌感染免疫功能（ScientificReports,2016）。最近，该课题组又发现PtpA不仅可在宿主细胞质中调控固有免疫信号通路，还可进入宿主细胞核内（图1）。ChIP-seq分析结果提示：PtpA在宿主细胞核内可调控一系列宿主基因的表达，这些基因主要涉及免疫调控（如TNFRSF8）以及细胞增殖和迁移（如GADD45A）等生物学功能。进一步研究发现PtpA可直接结合至GADD45A基因的启动子区并抑制该基因的转录，并进而促进人非小细胞肺癌A549细胞的增殖和迁移能力及其在裸鼠中的成瘤能力，且该调控功能依赖于PtpA的DNA结合能力而不依赖于其磷酸酶活性。此外，受PtpA调控的宿主细胞核内的潜在靶基因中还包括某些与肿瘤发生发展密切相关的非编码RNA基因（如miR-488、CASC2和miR-622）（图2）。该研究发现了首个可进入宿主细胞核内调控宿主免疫及细胞增殖功能的Mtb效应蛋白PtpA，揭示了Mtb可通过其分泌的效应蛋白在特定情况下促进肺癌发生发展的分子机制。
相关结果已在国际权威期刊NatureCommunications《自然通讯》在线发表，题为“ThemycobacterialphosphatasePtpAregulatestheexpressionofhostgenesandpromotescellproliferation”。刘翠华课题组的助理研究员汪静、研究生葛浦浦为该文章的共同第一作者，刘翠华研究员为该文的通讯作者。该研究得到了国家科技部、国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委和中科院的资助。
文章链接：http://www.nature.com/articles/s41467-017-00279-z.pdf
图1.MtbPtpA可进入宿主细胞核内
图2.宿主细胞核内的MtbPtpA抑制固有免疫功能并促进肿瘤细胞增殖的机制示意图
非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
目前认为仅有肿瘤干细胞具有形成集落的能力，集落抑制率常用于抗癌药物敏感试验、肿瘤放射生物学试验。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%
（一）原理
细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品
1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法
1.平板克隆形成试验
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置 37℃ 、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
2.软琼脂集落形成试验
本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。
（1）同上（1）~（3）步骤。
（2）调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。
（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在 40℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。
（4）制备上层琼脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。
（四）实验结果
1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。
2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数，然后按下式计算集落形成率：
集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100
（五）注意事项
1.琼脂对热和酸不稳定，如果反复加热，容易降解，产生毒性，同时琼脂硬度下降。故琼脂高压灭菌( 10磅 15分钟)后按一次用量进行分装。
2.细胞悬液中，细胞分散度>95%。
3.软琼脂培养时，注意琼脂与细胞混合时温度不要超过 40℃ ，以免烫伤细胞。
4.接种细胞密度不宜过高。
5.细胞在低密度条件下培养，生存率明显下降，无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培养细胞和有限细胞系仅为0.5~5%,甚至为零。为提高集落形成率，必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。
1，如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10Mm的话，将会100%抑制。
2，CCK-8试剂的保存条件？
在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
3，预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
4，CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
5，悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
6，应该每次做标准曲线吗？
建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
7，有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
8，实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？
需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
9，如果OD值太低，可以采取什么办法？
可以采取2个办法：①适当增加细胞数量。②延长加入CCK-8试剂后的染色时间。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
细胞分化，产生的是不同的细胞，例如造血干细胞可以分化出红细胞。
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