Biological Activity
Cytotoxic agent. Inhibits thymidylate synthetase and de novo purine synthesis. Potent folic acid antagonist; inhibits dihydrofolate reductase. Also inhibits Ras carboxyl methylation in DKOB8 cells, leading to decreased p44 and Akt activation.
Technical Data
| M. Wt | 454.44 |
| Formula | C20H22N8O5 |
| Storage | Store at RT |
| Purity | ≥99% (HPLC) |
| CAS Number | 59-05-2 |
| PubChem ID | 126941 |
| InChI Key | FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N |
| Smiles | O=C(N[C@H]([C@](O)=O)CCC(O)=O)C(C=C3)=CC=C3N(CC2=NC1=C(N)N=C(N)N=C1N=C2)C |
The technical data provided above is for guidance only. For batch specific data refer to the Certificate of Analysis.
All Tocris products are intended for laboratory research use only.
Solubility Data
| Solubility | Soluble to 100 mM in DMSO |
Preparing Stock Solutions
The following data is based on the product molecular weight 454.44. Batch specific molecular weights may vary from batch to batch due to solvent of hydration, which will affect the solvent volumes required to prepare stock solutions.
| Concentration / Solvent Volume / Mass | 1 mg | 5 mg | 10 mg |
|---|---|---|---|
| 1 mM | 2.2 mL | 11 mL | 22.01 mL |
| 5 mM | 0.44 mL | 2.2 mL | 4.4 mL |
| 10 mM | 0.22 mL | 1.1 mL | 2.2 mL |
| 50 mM | 0.04 mL | 0.22 mL | 0.44 mL |
Molarity Calculator
Reconstitution Calculator
Dilution Calculator
Product Datasheets
References
References are publications that support the products' biological activity.
Allegra et al (1987) Evidence for direct inhibition of de novo protein synthesis in human MCF-7 breast cells as a principal mode of metabolic inhibition by methotrexate. J.Biol.Chem. 262 13520 PMID: 2443493
Chu et al (1990) Mechanism of thymidylate synthase inhibition by methotrexate in human neoplastic cell lines and normal human myeloid progenitor cells. J.Biol.Chem. 265 8470 PMID: 2341391
Jolivet et al (1983) The pharmacology and clinical use of methotrexate. N.Engl.J.Med. 309 1094 PMID: 6353235
Winter-Vann et al (2003) Targeting Ras signaling through inhibition of carboxyl methylation: an unexpected property of methotrexate. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 100 6529 PMID: 12750467
Keywords: Methotrexate, supplier, Cytotoxic, agent, Dihydrofolate, reductases, inhibitors, inhibits, Cell, Cycle, DHFR, chemotherapeutics, Dihydrofolate, Reductase, Cell, Cycle, Inhibitors, Cell, Cycle, Inhibitors, Tocris Bioscience
TocrisBioscience是一家专卖生命科学研究chemicals,peptidesandantibodies的知名品牌，其产品也广为各大药厂、大学、研究机构，超过五万名科学研究者所采用。目前，產品內容已超過一千六百種以上，並每年持續不斷的增加新的產品。目前，产品内容已超过一千六百种以上，并每年持续不断的增加新的产品。 Tocrisbioscience是位于英国布里斯托尔（Bristol）的高品质试剂提供商，共有2000多种产品，主要集中在神经科学和信号传导领域，产品类型包括小分子、多肽、抗体、配体和化合物筛选文库等，主要产品包括GPCRligands，神经传递素，离子通道调控剂，信号通路抑制剂等，这些产品被广泛选择性地用于阻断或激活生物学通路。Tocris是世界上神经科学研究领域无可争议的领导者，其生产的影响神经系统的化学物质被多次引用，这些物质很多都来自JeffWatkins（Tocris的创立人）在Bristol大学原创性的研究工作。 TocrisBioscience的主要产品包括：SmallMoleculesPeptidesAptamersControlledSubstancesCompoundLibrariesDREADDLigandsFluorescentImagingLigandSetsOptopharmacologyReagentsToxins 按照研究领域细分：CancerCardiovascularSystemEndocrinologyImmunologyNeurosciencePain&InflammationRespiratorySystem
关于Tocris高品质生命科学试剂的领先供应商超过三十年来，TocrisBioscience一直与科学家携手合作，致力于为生命科学研究提供最尖端和最具创新性的研究工具。我们了解，对于研究人员，试剂的可靠性是至关重要的，从这一点出发，我们为客户提供最高品质的产品，让您在发表研究成果时倍感自信。要了解关于Tocris的更多信息，请点击下方的图块。Tocris是Bio-Techne的分支机构，专精于生命科学领域，旗下包含多个著名品牌，如 R&DSystems、NovusBIOLOGicals、ProteinSimple 和 AdvancedCellDiagnostics。Bio-Techne汇聚众多品牌的力量，为研究人员提供全方位的产品，包括研究试剂、定量分析和蛋白质分析平台。要了解关于Bio-Techne及其旗下品牌的更多信息，请访问 bio-techne.com。Tocris职业发展环境保护活动和会议授权我们的理念我们的历史Tocris新闻
TocrisBioscience主要产品分类 1、小分子在生物科学中，小分子作为研究材料具有许多优点，它们可设计成是选择性的、有效的、水溶性的或细胞可渗透的。应用作为激动剂和GPCR的拮抗剂，以及酶抑制剂，核受体配体和离子通道调节剂。许多常用药物是小分子，不像肽和蛋白质，它们可被设计为代谢稳定和口服活性。2、肽肽是由酰胺键连接的α-氨基酸形成的链。肽通常由20种天然存在氨基酸与非天然氨基酸组成。3、对照底物对照底物包含药物或化合物，来自于英国药物生产商的前沿技术。4、毒素毒素是由活细胞或组织产生的有毒物质。5、复合笼利用光解技术，使邻近的受体配体释放，防止扩撒效应。6、光控开关配体光控开关配体是光敏感的化合物，不同波长的光应于神经元的离子通道和受体的调节，能控制神经信号的强度。7、荧光探针结合到受体或蛋白质的荧光探针使研究人员能够检测的复杂生物分子的组件，如活细胞，具有高灵敏度和选择性。Tocris也提供荧光染料、标签等。8、筛选文库9、其他试剂
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1，CCK-8能否对活细胞进行染色？
不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。
2，CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？
CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。
3，在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
4，每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
可能会有以下几个原因：1.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
5，如何设定空白对照？
在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。
6，哪些物质会影响CCK8的测定？
当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等(一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
7，在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
8，设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？
不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
9，说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？
一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
10，在CCK-8显色过程中，如何终止反应？
有一下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl0.1MHCL溶液。③每孔加10μl的1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
11，必须预培养细胞吗？
不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。检测
1.MTT。
MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT法检测细胞增殖算是比较常用的方法了，价格便宜，不过其甲瓒产物不溶于水，需有机溶剂溶解后方可检测，其增加了工作量，同时对结果的准确性产生影响，重复性较差吧。
2.CCK8
CCK8检测原理：CCK8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。
相比较于MTT而言，CCK8的灵敏度要更高，其生成的甲瓒产物溶于水，重复性和准确性上要优于MTT法，对于细胞的毒性较小，不过价格也是相比MTT要贵一截。
3.通过标记DNA检测细胞增殖的常用的大概是Brdu和EDU用的比较多。
Brdu是一种胸腺嘧啶核甘类似物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）参入正在复制的DNA中，之后我们通过抗Brdu的抗体与荧光二抗快速检测细胞的DNA复制活性。EDU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，类似于一种化学反应吧，而无需抗原抗体结合。
相比较而言，Brdu或者edu更适合用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其药物筛选等。同时Brdu或者EDU也适用于小鼠，大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。关于Brdu和EDU的各自优缺点可以参考下帖。具体问题具体分析吧，目前来看EDU检测越来越普遍吧。关于Brdu检测细胞增殖，一种可以使用免疫荧光通过Brdu-FITC与DAPI双染判断细胞的增殖情况。
一般对于细胞来说都是免疫荧光的常规步骤吧，只是需要一步盐酸进行变性DNA和中和。
1.细胞铺板24孔板或者6孔板。可以进行加药处理细胞
2.加入一定终溶度的BrdU继续培养一定的时间。随后弃去孔内溶液，PBS润洗3次。
3.4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS再润洗3次
4.0.1％TritonX-100处理细胞15min后，接着PBS润洗3次
4。接着2MHCl处理30min，再加入0.1M的硼酸中和10min，PBS润洗3次。
5.滴加5％BSA室温封闭30min，弃去液体，滴加1:200稀释的BrdU一抗，4℃孵育过夜。
6.次日，弃去一抗，PBS润洗5次，在避光条件下，滴加1:50稀释FITC标记二抗，室温孵育1h后，PBS再润洗5次。
7.pbs洗5遍，滴加DAPI溶液，室温孵育5到10分钟，PBS洗5遍。
8.荧光显微镜观察。拍照。只是需要注意的是细胞固定这一块吧，如果细胞固定不好的话，细胞容易连在一起而无法分清S期和M期等。同时容易造成细胞碎片吧。
附张失败的图片。
文献中完美的图片：
图片来源：EthanolinducescytostasisofcorticalbasalProgenitors
4.关于EDU，目前一般都是拿试剂盒做的，操作简单方便。步骤相比Brdu而言，少了DNA变性，无需抗体孵育等环节。
由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,Mtb）引起的结核病是一种古老的慢性传染病，并且至今仍是全球死亡人数最多的单一传染病。据世界卫生组织（WHO）报道：2015年全球有1040万新发结核病患者，有180万人死于结核病。Mtb是一种胞内病原菌，可分泌多种效应蛋白至宿主细胞中，进而干扰细胞信号通路和生物学功能，最终促进病原菌在宿主细胞中的存活并导致宿主细胞病变。中国科学院微生物研究所刘翠华课题组长期致力于研究Mtb等重要病原菌与宿主相互作用的分子机制，近年来先后在NatureImmunology,TheJournalofImmunology等杂志发表系列研究工作，发现了Mtb通过分泌一系列效应蛋白调控宿主细胞功能进而逃逸宿主固有免疫清除的新机制，并揭示了病原菌与宿主间相互博弈的动态过程及分子机制，为抗结核药物研发提供了新思路和特异靶点。
近年来，越来越多的研究表明病原微生物（包括多种病毒和细菌等）感染引起的慢性炎症可增加肿瘤发生发展的危险性，有关感染相关的慢性炎症诱发肿瘤的分子机制研究已成为当前生物医学领域的热点之一。然而，Mtb导致的慢性感染与肺癌的相关性至今尚无定论，关于Mtb效应蛋白在肿瘤发生发展中的分子调控机制更是知之甚少。刘翠华课题组之前的研究表明：Mtb效应蛋白PtpA（一种真核样酪氨酸磷酸酶）可被分泌至宿主细胞中结合泛素分子并被后者激活，进而去磷酸化宿主的p-JNK和p-p38并抑制JNK/p38信号通路的激活；同时PtpA还能以磷酸酶活性非依赖性的方式抑制NF-κB信号通路的激活（NatureImmunology,2015）。进一步的研究发现PtpA的宿主互作蛋白TRIM27（一种泛素连接酶）可作为宿主限制因子抑制分枝杆菌在巨噬细胞内的存活，而PtpA则可通过结合TRIM27蛋白的RING结构域而拮抗TRIM27介导的抗病原菌感染免疫功能（ScientificReports,2016）。最近，该课题组又发现PtpA不仅可在宿主细胞质中调控固有免疫信号通路，还可进入宿主细胞核内（图1）。ChIP-seq分析结果提示：PtpA在宿主细胞核内可调控一系列宿主基因的表达，这些基因主要涉及免疫调控（如TNFRSF8）以及细胞增殖和迁移（如GADD45A）等生物学功能。进一步研究发现PtpA可直接结合至GADD45A基因的启动子区并抑制该基因的转录，并进而促进人非小细胞肺癌A549细胞的增殖和迁移能力及其在裸鼠中的成瘤能力，且该调控功能依赖于PtpA的DNA结合能力而不依赖于其磷酸酶活性。此外，受PtpA调控的宿主细胞核内的潜在靶基因中还包括某些与肿瘤发生发展密切相关的非编码RNA基因（如miR-488、CASC2和miR-622）（图2）。该研究发现了首个可进入宿主细胞核内调控宿主免疫及细胞增殖功能的Mtb效应蛋白PtpA，揭示了Mtb可通过其分泌的效应蛋白在特定情况下促进肺癌发生发展的分子机制。
相关结果已在国际权威期刊NatureCommunications《自然通讯》在线发表，题为“ThemycobacterialphosphatasePtpAregulatestheexpressionofhostgenesandpromotescellproliferation”。刘翠华课题组的助理研究员汪静、研究生葛浦浦为该文章的共同第一作者，刘翠华研究员为该文的通讯作者。该研究得到了国家科技部、国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委和中科院的资助。
文章链接：http://www.nature.com/articles/s41467-017-00279-z.pdf
图1.MtbPtpA可进入宿主细胞核内
图2.宿主细胞核内的MtbPtpA抑制固有免疫功能并促进肿瘤细胞增殖的机制示意图
1，一个孔中应接种多少个细胞？
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
能否用384孔板进行试验？
2，可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。
3，能否用24孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
4，酚红会影响检测吗？
不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
5，CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
6，CCK-8能否检测细菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μlE.coli培养液中加入10μlCCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
7，CCK-8稳定吗？
CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。
8，如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
还可使用450nm到490nm之间的滤光片。
9，如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
10，CCK-8是什么颜色？
应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
解析：细胞增殖是重要的细胞生命特征。
如题。以及下面问题：
要检测转基因小鼠（不知道）和正常鼠细胞免疫的改变（T细胞）需要做那些实验？
非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
目前认为仅有肿瘤干细胞具有形成集落的能力，集落抑制率常用于抗癌药物敏感试验、肿瘤放射生物学试验。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%
（一）原理
细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品
1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法
1.平板克隆形成试验
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置 37℃ 、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
2.软琼脂集落形成试验
本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。
（1）同上（1）~（3）步骤。
（2）调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。
（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在 40℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。
（4）制备上层琼脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。
（四）实验结果
1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。
2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数，然后按下式计算集落形成率：
集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100
（五）注意事项
1.琼脂对热和酸不稳定，如果反复加热，容易降解，产生毒性，同时琼脂硬度下降。故琼脂高压灭菌( 10磅 15分钟)后按一次用量进行分装。
2.细胞悬液中，细胞分散度>95%。
3.软琼脂培养时，注意琼脂与细胞混合时温度不要超过 40℃ ，以免烫伤细胞。
4.接种细胞密度不宜过高。
5.细胞在低密度条件下培养，生存率明显下降，无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培养细胞和有限细胞系仅为0.5~5%,甚至为零。为提高集落形成率，必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。
