Cellular senescence is a state where cells can no longer divide, despite the presence of appropriate growth factors. This state can be induced either by telomere shortening (replicative senescence) or by telomere-independent signals, such as deoxyribonucleic acid (DNA) damage and oxidative stress (stress-induced senescence). The state of cellular senescence is associated with the following: irreversible growth arrest; a distinct flat, and enlarged cell morphology; an increase in senescence-associated ß-galactosidase (SA ß-gal) activity; and the expression of cell cycle inhibitors, such as p16INK4a and p21CIP1/WAF1/Sdi1
BioPioneer providesasimple andrapid test for identifying senescent cells and gives science a powerful new tool for examining senescence. This kit is designed to detect SA-beta-galactosidase which catalyzes the hydrolysis of X-gal and produces a blue color in senescence at pH6.0.
Kit Contents:
10X Fixative Solution 15 ml
X-Gal 150 mg
10X Staining Solution 15 ml
100X Staining Solution Supplement A: 1.5ml
100X Staining Solution Supplement B:1.5ml
Materials Supplied by the User
- 1X PBS (Phosphate Buffered Saline):
- N-N-dimethylformamide (DMF)
- 50% glycerol (optional)
- 37°C incubator
- Phase contrast or light microscope
- Polypropylene tubes
Solution Setup
The following protocol is designed for one 35 mm well of a 6-well plate. (1 ml for 35 mm wells/plates, 2.5 ml for 60 mm plates and 5 ml for 100 mm plates).
Polypropulene tubes must be used duringsolution preparation.
1. Prepare a 6ml 1X PBS solution for each 35mm well (not provided).
2. Dilute the 10X Staining and 10X Fixative Solutions with distilled water to make 1X solutions. You will need 930 ul of 1X Staining Solution and 1 ml of 1X Fixative Solution per 35 mm well.
3. Dissolve 20 mg X-gal in 1 ml DMF to prepare a 20X stock solution. Excess X-gal solution can be stored at -20°C in a light resistant container for one month.
Assay Protocol
1. Aspiratethe growth medium from the cells and wash the plate once with 2 ml 1X PBS.
2. Add 1 ml 1X Fixative Solution to the cellsand incubate for 5-10 minutes at room temperature.
3. During the fixingprocess , preparethe Staining Solution.
a. 930 ul Staining Solution
b. 10 ul Staining Supplement A
c. 10 ul Staining Supplement B
d. 50 ul 20 mg/ml X-gal in DMF
4. Remove the fixing solution and wash the fixed cells twice with 2 mL of 1X PBS.
5. Add 1 ml Staining Solution mix to the plate. Incubate 5 hours toovernight at 37°C.
6. Check the cells under a microscope (200 x total magnification) for development of blue color.
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻（cyanobacteria）中提取的触角光合色素（photosynthetic antenna pigments）。这些生物大分子都含有多种胆汁三烯生色基团（bilin chromophores）。这些生色基团都包裹在一种基质结构中，这样就能将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。不过这些藻胆蛋白的“个头（分子量高达200KD）”也限制了它们在细胞内的扩散，因此，它们也只能与抗体联用，在流式细胞术试验或ELISA试验中用来检测细胞表面的蛋白质分子。
自从科学家从维多利亚发光水母（jellyfish Aequorea victoria）中发现了绿色荧光蛋白（GFP）之后，生物成像领域就发生了革命性的改变。单独表达绿色荧光蛋白或与其它蛋白融合表达就可以在细胞内发出绿色荧光了，使用这种方法除了需要氧气O2之外，不再需要任何其它的试剂参与，因为生色基团是通过自发环化作用形成的，需要对深埋在直径约2.4纳米至4纳米的β桶（beta barrel）核心里的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-氨基乙酸）进行氧化才能发出荧光。绿色荧光蛋白只是荧光蛋白大家族中的一员，这些荧光蛋白大部分都来自海洋腔肠动物，因为各自含有共价结构不同以及非共价环境不同的生色基团，所以可以发出不同颜色的荧光。在实验室中对这些荧光蛋白进行遗传修饰之后可以进一步的丰富它们的特性，比如增加亮度和折叠效率、减少寡聚体形成等。突变既可以增加荧光蛋白的光稳定性，还可以赋予荧光蛋白光操控性，比如控制荧光发射与否，或者发出哪种荧光。这种光操控性既可以是可逆的也可以是不可逆的，可以用于监测蛋白的弥散过程、运输过程和老化过程等。虽然荧光蛋白在生色基团形成的过程中会生成H2O2，但似乎没有产生太多的活性氧簇（ROS），这一点也并不奇怪，因为荧光蛋白在进化过程中都是暴露在阳光下的。不过我们也可以对荧光蛋白进行改造使其能够形成ROS。荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感，但是酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光。不过现在我们已经有了经过改造的、能耐受酸性环境或者能对金属离子、卤化物离子和巯基二硫化物氧化还原剂起反应的荧光蛋白。展开
（2）荧光标记法 ： 使用二乙酸荧光素（FDP）、碘化丙啶（PI）或异硫氰酸荧光素钠标记的荧光染料与细胞共孵育，用流式细胞仪检测荧光染色阳性细胞的比率。此法其实是（1）法的“荧光”版，但其在灵敏性和准确性方面明显要优于后者。
（3）硝酸镧(La)示踪法： 在正常的生物组织中镧微粒可沉积于细胞间隙，但不能穿过具有1~ 2nm 微小间隙的细胞膜性结构(包括细胞膜和细胞器膜)，也不能穿过细胞间的紧密连接。在膜性结构通透性增高时， 镧微粒则可进入细胞、细胞器和紧密连接内， 并在电镜下显示， 镧盐标记技术被认为是一种有效的监测细胞膜通透性变化的标记技术。
（4）LDH释放法： 在正常情况下，细胞内大分子物质LDH 是不能通过细胞膜的， 但在细胞膜受损伤而通透性增加时，可通过受损的细胞膜释放出来。LDH 能较好地反映细胞膜损伤程度。类似的还有检测细胞外K+的漏出率等。
可以用CCR3的抗体标记其他细胞，再反推中性粒细胞所占的比例吗？肺泡灌洗液中主要有嗜酸性粒细胞，淋巴细胞，中性粒细胞和巨噬细胞。
比如你用的CD1a－FITC（如果是鼠单抗IgG1，那对照抗体就要用相同物种的非特异性IgG1-FITC）。注意浓度要相同。一般提供抗体的公司BD，santa cruz等有提供的。其他就按照说明书的推荐浓度和孵育时间。
