【求助】酵母细胞破碎

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紫竹林之舞

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楼主，我正在提酵母中的dna呢，呵呵。同志啊提了两天了，还没有成功。前天大提了一次，最后竟然一点也没有。然后昨天我把前天大题离心下来的菌体再重新破壁了1个小时，然后就提出来了。但量太少了，等除了rna后竟然又消失了，郁闷今天有提了一下，破壁3个小时，提取不出来，现在在提破壁6小时的，希望一会儿能提出来。同时现在大题破壁，准备过夜破壁，明天接着提。估计是破壁不成功，需要很长时间破壁才成。下面是我的提取流程，仅供参考，呵呵接种C18和C19于25 ml的YEPD液体培养基中，30℃ 200rpm摇床培养10小时至对数生长期取5ml培养液3000 rpm离心5 min，弃上清，TE（1mM EDTA；10mM Tris-HCl, pH8.0）洗涤两次加入500μl裂解混合液（1mM EDTA；10mM Tris-HCl, pH8.0；1% SDS），65℃水浴30min。3000rpm离心5min，吸取上清加入等体积缓冲液（苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1），混匀，12000rpm离心10min，取上清，重复两到三次直到分界层没有白色蛋白质回收上清液加入两倍体积的无水乙醇（异丙醇），-20℃静置20～30 min，12000rpm离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤一次自然干燥后溶于100μl的TE中，加1％ 10mg/ml的RNA酶A的母液（10mg/mL，上海生工），37℃水浴处理30min后备用。

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陈乐乐

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可以用lyticase，我用的tiangen的，3000个单位的包装才150元。我是提RNA，根据promega sv total rna isolation 里要求的破壁方法，1、将适量酵母于合适培养基、合适温度培养过夜，第二天，将培养物用同样培养基按1：50稀释后继续培养，直到OD600达到0.6-1.0，这一般需要短短几小时。（测酵母数，我得一份量为2×10^7次方，如果你的量大，按比例加入下列裂解液）2、14000g离心2min。3、将离心得到的沉淀溶解于100ul溶液（高压灭菌即可）中：组成：1M 山梨醇0.1M EDTA(Ph 7.4)在使用前加入0.1%巯基乙醇和50个单位的lyticase。(0.1%是体积比)4、在30℃孵育15-30min直到溶液变为澄清。(我的是20分钟虽然不是特别澄清，但是镜检大约90%都已经变成原生质体了)效果还是不错的，你可以试试啊，如果不行的话可以考虑加大lyticase的量或者孵育时间。

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hosea

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用酸洗玻璃珠试试呢？用蜗牛酶试看看呢？有的公司好像有酵母细胞专用的裂解液买，你可以了解一下。我想你还可以加液氮研磨试试，提细胞RNA时用到的方法。

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liuyujia

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哦，谢谢泥！因为想提取物质，所以不想引入太多的杂质。用酸洗玻璃珠怎么操作呢，加入后剧烈振荡就可以吗？如果用液氮是不是要尽量使样品干燥，可是发酵得到的酵母泥稀稀的，恐怕不好磨哦。

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cookiecooky

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酸性玻璃珠法主要是用来提取DNA的时候使用，要求玻璃珠的直径约为500微米，sigma有售，不过价格较高。如果楼主是用来提取蛋白及其他活性物质的话建议还是使用高压细胞破碎机，它的原理是利用高压使细胞破碎，不会引入其他杂质，很多企业利用酵母表达的商业用酶都过来用我们这套系统来做破碎，效果不错。

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liuyujia

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我也看到很多是用那种仪器，不过我们这儿好像没有，贵吗？你是哪里呢？

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raimi

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liuyujia 哦，谢谢泥！因为想提取物质，所以不想引入太多的杂质。用酸洗玻璃珠怎么操作呢，加入后剧烈振荡就可以吗？如果用液氮是不是要尽量使样品干燥，可是发酵得到的酵母泥稀稀的，恐怕不好磨哦。‘如果用液氮是不是要尽量使样品干燥，可是发酵得到的酵母泥稀稀的，恐怕不好磨哦”，嘿嘿，这个不用担心，你的酵母泥稀稀在倒入液氮后就会变得如铁石般硬。一般我们操作时是把液氮先倒入一个大研钵，再把“酵母泥稀稀”滴加到里面，会形成小颗粒和絮状凝固物。然后再研磨。呵呵，研磨过程中可以多次添加液氮，，液氮挥发干时再研磨，重复三四次就OK了。试试，嘿嘿

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liuyujia

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那就这样磨磨我的“酵母泥稀稀”试试吧，呵呵。。。。谢谢！

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紫竹林之舞

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楼主，我正在提酵母中的dna呢，呵呵。同志啊提了两天了，还没有成功。前天大提了一次，最后竟然一点也没有。然后昨天我把前天大题离心下来的菌体再重新破壁了1个小时，然后就提出来了。但量太少了，等除了rna后竟然又消失了，郁闷今天有提了一下，破壁3个小时，提取不出来，现在在提破壁6小时的，希望一会儿能提出来。同时现在大题破壁，准备过夜破壁，明天接着提。估计是破壁不成功，需要很长时间破壁才成。下面是我的提取流程，仅供参考，呵呵接种C18和C19于25 ml的YEPD液体培养基中，30℃ 200rpm摇床培养10小时至对数生长期取5ml培养液3000 rpm离心5 min，弃上清，TE（1mM EDTA；10mM Tris-HCl, pH8.0）洗涤两次加入500μl裂解混合液（1mM EDTA；10mM Tris-HCl, pH8.0；1% SDS），65℃水浴30min。3000rpm离心5min，吸取上清加入等体积缓冲液（苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1），混匀，12000rpm离心10min，取上清，重复两到三次直到分界层没有白色蛋白质回收上清液加入两倍体积的无水乙醇（异丙醇），-20℃静置20～30 min，12000rpm离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤一次自然干燥后溶于100μl的TE中，加1％ 10mg/ml的RNA酶A的母液（10mg/mL，上海生工），37℃水浴处理30min后备用。

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劲松傲雪

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纯培养酵母菌的少量基因组DNA的提取可以使用反复冻融法，比较省时省力。我使用该方法对于DGGE已经足够了；另外，如果经费允许，可以使用试剂盒，国产的也不贵，50次的500元左右吧。

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紫竹林之舞

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昨天破壁六个小时的竟然什么也没有，郁闷呀！！今天提昨天破壁过夜的，上帝保佑我吧！呵呵

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紫竹林之舞

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回报一下，破壁过夜的提取出来了，呵呵但是在过夜的过程中，我是不是的适当剧烈的振荡了一下，好多基因组都碎了，胶上一片都很亮。所以以后要注意，延长破壁时间，但摇匀时不要剧烈，呵呵

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liuyujia

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紫竹林之舞，恭喜你哦！我现在不提dna,关键是破壁，不过你的方法相信以后肯定值得借鉴的。有一本‘酵母遗传学方法实验指南’上的提取方法和你的差不多，不过加入裂解液后没有水浴处理，而是加玻璃珠剧烈振荡。我正打算尝试一下，不知对你是否有用：）

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liuyujia

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紫竹林之舞，恭喜你哦！我现在不提dna,关键是破壁，不过你的方法相信以后肯定值得借鉴的。有一本‘酵母遗传学方法实验指南’上的提取方法和你的差不多，不过加入裂解液后没有水浴处理，而是加玻璃珠剧烈振荡。我正打算尝试一下，不知对你是否有用：）

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紫竹林之舞

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一般来说加玻璃珠速度会快些。很多论文中都是这样破的。但是玻璃珠比较贵，买不起，呵呵

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tiantian200102

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楼主是要提里面的活性产物吗?我以前用过丙酮,不知对你的酵母是否有效.具体方法:取发酵液,加入2倍于其体积的丙酮超声处理一定时间(具体的菌所需时间不同,我一般超2h）然后静置１２h左右，离心，蒸去丙酮。你试试吧，不知对你是否有用。

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liuyujia

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我以前用丙酮提取过发酵液，不过不太理想。你用丙酮除了提取物质，对超声波破壁也用一定作用吗？我想因为目的产物不同，所需溶剂也不同吧，不过还是谢谢你哦！玻璃珠还好吧，我买了10g，人民币165元，应该可以重复利用啊，呵呵。。。和这么多热心的战友交流，真的很开心，觉得实验都有趣了！谢谢大家！

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陈乐乐

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可以用lyticase，我用的tiangen的，3000个单位的包装才150元。我是提RNA，根据promega sv total rna isolation 里要求的破壁方法，1、将适量酵母于合适培养基、合适温度培养过夜，第二天，将培养物用同样培养基按1：50稀释后继续培养，直到OD600达到0.6-1.0，这一般需要短短几小时。（测酵母数，我得一份量为2×10^7次方，如果你的量大，按比例加入下列裂解液）2、14000g离心2min。3、将离心得到的沉淀溶解于100ul溶液（高压灭菌即可）中：组成：1M 山梨醇0.1M EDTA(Ph 7.4)在使用前加入0.1%巯基乙醇和50个单位的lyticase。(0.1%是体积比)4、在30℃孵育15-30min直到溶液变为澄清。(我的是20分钟虽然不是特别澄清，但是镜检大约90%都已经变成原生质体了)效果还是不错的，你可以试试啊，如果不行的话可以考虑加大lyticase的量或者孵育时间。

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qwqwe2000

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借问一下巴斯德毕赤酵母的破壁方法同酿酒酵母的破壁方法是否相同？我提取毕赤酵母的DNA，得率也很低，采用的是《酵母遗传学方法实验指南》的方法。

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陈乐乐

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应该可以。不知道你的酵母细胞壁能有多厚，以及细胞多糖脂肪含量。不过我看说明书上没说是针对酿酒酵母，只说是对于yeast。你可以调整酶量及时间看看效果，用镜检来判断。上次有人提橘林油脂酵母，用“酵母遗传学操作手册”上的传统方式就不是很好，可能他的酵母富含油脂？后来采用promega的wizard dna purification kit效果就好多了。（不是做广告，是实验室正好有前人留下的一大盒）至于lyticase，我也是上蚂蚁淘查到看大家推荐用lyticase，我觉得比蜗牛酶能单纯一些，不是酶的混合，一查sigma的，倒不是因为贵而是到货周期太长实验来不及了，才查了查买了tiangen的，没想到这么便宜，是液态已溶解好的。

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zhaoxihong

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大家好，我以前提了毕赤酵母的基因组，后来用它作模板来pcr，结果什么都没有，我想请问一下提完基因组后，可以先跑电泳看看是否已经提出来了吗？还有我就按照invirogen上的说明书做的阿，但是没有买他们指定的酶，我用的是蜗牛酶，不知道可以吗？大家谁能帮助我一下啊，我都在这卡了很长时间了！！！！！！！！！！！

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陈乐乐

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做PCR前怎么能不检测DNA的质量呢？

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wxf1206_0

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酵母的细胞壁的主要成份是葡聚糖和甘露聚糖，而且壁比较厚，所以破碎酵母细胞有一定的困难，我曾试过多种方法来进行破碎酿酒酵母细胞提取重组蛋白，其中有一种比较简便也比较有效的方法就是用高压细胞破碎机来物理破碎酵母细胞，我用的机器是JG-II压细胞破碎机（宁波新科器研究所制造），条件为：18Mpa，等压力升上去，维持15s，反复进行3次，基本上就可以完全破碎酵母细胞，可以通过显微镜来观察细胞的形态！

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zhanghaiqiang112

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楼主。。有相关提取酵母全蛋白的方法吗？？做双向电泳的。。。**啊！！！

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paroxysm

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lyticase是尽量要加的啊