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ELISA试剂盒很多牌子都不错，关键看灵敏度、实验效果、技术支持以及实验经费来决定

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。

抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。

抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤

多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。

具体实验步骤如下：

1.兔子的准备

挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.

预采血（作阴性参照用）

1.1将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；

1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；

1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；

1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；

1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；

1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min；h.收集上清，即为血清。

2.兔子的免疫

2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。

2.2将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；

2.3小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

2.4免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。

3.效价检测

3.12个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清

3.2于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。

3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间,37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。

3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1小时。

3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。

3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（Sigma单组份TMB）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。

3.8每孔加入50ul的终止液（2NH2SO4），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。

抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。抗体的纯化

4.抗体的亲和---亲和柱的制备

4.1称取1mgCNBr-Sepherose4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。

4.2将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml2mmol／L的盐酸洗介质3次。

4.3用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。

4.4将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中

4.5室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。

4.6加入15ml1%BSA溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。

4.7用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上h.

4.8抗原固相化完成，可用于纯化。

4.9若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。

5.抗血清的纯化和保存

5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.

5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。

5.3将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。

5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜

5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白

5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体

5.7用10倍体积PBS平衡柱子

5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。

在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。

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如何辨别滤芯
　　1、一般好的滤芯总是比较整齐：大品牌的滤芯在色泽上也比较白净、光鲜，如果差的滤芯没孔不通畅，而且材质发黄，保存不好的有发霉迹象，因为滤芯被安置在净水器内部，所以看起来比较困难，而市场上销售的滤芯样品是千挑万选的，所以看不出来问题。因此购买之前，尽量叫销售人员拆装；虽然要求过分，但是管用。当然这也只能从外观上判断，专业的做法是要气压试水，如果漏气，则滤芯不达标。消费者无法测试气压，只能在使用过程中体验，所以对售后服务要求比较高。
2、还有一种方法是看滤芯的外壳材质：一般厂家都使用食品级ABS材料（色泽黄，光滑，而且，个别为了节约成本，使用PVC（日丰管，下水道使用，白色，无光泽）。

对多糖类有效部位新药药学研究的建议
正文审评二部李计萍

多糖广泛存在于动物、植物、微生物等有机体中，来源很广。其中研究较早且最多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗生产。多糖的研究起自20世纪60年代，从20世纪70年代开始逐渐发现多糖及其复合物(蛋白多糖和脂多糖)具有多方面的药理作用，主要包括：增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、增强骨髓造血机能、抗辐射、对肝肾等主要脏器的保护作用等。
由于多糖多种多样的生物活性以及在保健、疾病治疗领域的广泛使用，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。笔者在近年的中药新药审评中遇到了一些以多糖为有效部位的新药，并且发现了一些值得讨论的问题。多糖的质量控制是一个全过程的控制，现就工艺研究、质量控制研究两个方面进行讨论。
一、工艺方面：
现阶段多糖类有效部位新药的申请相对较少，作为新药工业化生产的提取纯化方法还不成熟，以下介绍的一些方法，在多糖研究中虽比较常用，但应用于新药生产中是否可行，尚需深入研究，要结合品种特点及环保等因素综合考虑。
1、提取纯化
多糖的工艺研究一般包括提取、除脂、脱色、除蛋白、醇沉、柱分离纯化、透析等基本步骤。多糖的提取及分离纯化直接影响到成品中多糖的纯度，从而影响到多糖类有效部位的质量控制，最终影响到成品的疗效。
对多糖的提取纯化方法应根据不同的动、植物来源采用不同的方法进行提取纯化。为保证多糖提取较充分，首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖及微生物细胞内多糖的组织细胞多有脂质包围，一般先加入甲醇或1∶1的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂；含色素较高的根、茎、叶、果实类需进行脱色处理，然后用水、盐或稀碱水在不同温度下提取，应避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。一般植物多糖提取多采用热水浸提法，所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物。
在选择提取纯化方法时，应考虑所用方法对不同类别多糖及在大生产条件下的适应情况。如凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。
对于植物或动物中所含成分可能为糖肽的，应在提取纯化时注意不破坏其结构，并应通过结构分析及含量测定等方法，结合药效学试验，提供研究资料证明其有效部位为糖肽。
多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法三氯乙酸法,后者较为剧烈，对于含呋喃糖残基的多糖由于连接键不稳定，所以不宜使用。但该法效率较高，操作简便，植物来源的多糖常采用该法。上述三种方法均不适合于糖肽，因为糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。除去蛋白质后，应再透析一次，选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析，可以将不同分子大小的多糖进行分离和纯化，该法用于除去小分子物质十分实用，同时能满足大生产的需要，具有广阔的应用前景。至此，得到的提取液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。
对于透析、超滤及超速离心，选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析以及一定条件下的超速离心操作，可按分子大小将多糖样品分级，超滤和透析更常用于除去小分子物质。
但常用的去蛋白方法、透析、分级沉淀法等纯化方法，大生产时的可行性值得深入研究。
2、考察指标的选择
在审评中常见的问题是：仅用多糖或总糖的含量作为考察指标，无法说明提取纯化过程中多糖结构的变化、各多糖之间量的变化以及分子量分布的变化与药效的相关性。如审评的某一多糖类有效部位的新药，在提取分离、灭菌方法的研究中，以酸性多糖和中性多糖的含量、分子量分布情况、灭菌情况为指标，考察工艺过程。经研究发现：提取过程中通过乙醇分级纯化，分子量分布范围缩小。通过比较，高温及活性炭灭菌方法均对多糖含量有影响。后采用加一定浓度的酸进行灭菌，不同酸度，灭菌情况不同。在酸性条件下灭菌时，多糖发生了降解，分子量范围变小。当分子量降到一定范围时药效降低，虽然在整个过程中总多糖含量没有变化，但由于分子量分布发生了变化，导致药效发生了较大的变化。
因此，在提取纯化过程中应选择合适的考察指标。首先要根据多糖的存在形式及提取部位的不同，决定在提取之前是否做预处理。并且，对提取纯化的关键步骤均应进行成分组成及含量、药效的跟踪，以说明工艺的合理性。
3、有效部位的确定
目前，对多糖的研究一般表现为对多糖粗提物的生理活性的研究。多糖提取物的分子量分布较广，在多糖的提取纯化过程中，由于没有对其分子量进行分段，没有进行药效跟踪，没有除去单糖及寡糖等小分子物质，所以常常无法证实有效部位就是多糖。
不同结构的多糖，其药效不同，有的多糖没有明确的药理作用。反之，单糖和寡糖未必没有药理作用。因此，在提取纯化研究中有必要将多糖与单糖、寡糖等小分子物质分开，进行药效比较，说明有效部位所在。
在有效部位清楚后，需要最大限度地保留有效部位，除去其他成份。为此，要根据有效部位成份和杂质的特点选择适宜的分离纯化方法。
二、质量研究方面
1、理化性质及多糖的结构分析
在审评中我们发现，对多糖的理化性质虽有研究，但不系统、不深入。有的仅仅是做一些简单的说明，没有实质性的研究。
对多糖的理化性质研究是保证多糖质量的重要方面。研究资料显示，多糖的活性与分子量、溶解度、粘度、初级结构和高级结构等性质有关。概括起来，具有生理活性的多糖具备的特性是：①水溶性D－葡聚糖；②具线状结构或尽可能短的分枝；③具有D－螺旋型立体结构，且不被体液中的D－葡聚糖酶水解。有些多糖的一级结构相同，但活性不同，其原因是它们的二级结构和三级结构不同。因此搞清多糖中单糖的组成及立体结构具有重要的意义。
由于多糖的活性与分子量、比旋度、溶解度、特性粘度、纯度、初级结构和高级结构等有关，因此应对多糖分子量分布进行研究，对多糖的结构、组成、杂多糖中单糖组成成分进行分析。但对这些性质的研究均需将多糖纯化到一定的纯度如80％以上。所以对于单一多糖组成的新药，则需阐明该多糖中单糖的组成及其摩尔比，说明各组成单糖的连接键型。一般有效部位多糖为杂多糖，则必须阐明该混合多糖有那几种主要多糖组成及各多糖的比例，并说明主要多糖的分子量、组成多糖的单糖的种类及摩尔比。
多糖的结构分析方法有许多，一般为多糖样品经水解进行单糖的组成分析。
纸层析、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱、X-射线纤维衍射、毛细管电泳法等。
其中气相色谱法（GC）测定糖类开始于1958年，具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少、分析速度快等优点，是多糖结构分析中最重要的手段之一。它与质谱联用可以得出有关单糖残基类型、键的连接方法、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。GC要求试样具有良好的挥发性和热稳定性，多糖本身不能在高温下直接挥发，因而需要将大分子多糖降解为单糖或寡糖，并且将其衍生成具有易挥发、对热稳定的衍生物，进行测定。
毛细管电泳法（CE）是80年代后期迅速发展起来的一种分离分析技术，它以快速、高效和高灵敏度、所需样品少等特点正被广泛应用。一般多糖经酸或酶水解后进行CE，与标准品对照后计算出各单糖的峰面积进而推算出其单糖组成及其比率。定性分析主要通过进行多糖的指纹图谱来确定糖组成结构的特征。定量分析目前只限于多糖中某特定功能团和组成多糖各单糖的定量分析。
质谱技术如联动扫陈描、MS/MS方法、不同衍生化处理、同位素标记方法、GC/MC和LC/MC以及各软电离技术的配合使用，质谱法在糖的序列分析和结构鉴定研究中正越来越起着重要作用。
X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合可以从原子水平对多糖分子结构进行分析。大多数多糖均不能形成单晶，不适用于常规X-射线单晶衍射。而X-射线衍射的另一方式纤维衍射则在这方面展示了越来越大的应用空间，再加上立体化学方面的信息包括键角、键长、构型角和计算机模拟，就可以准确地确定多糖的构型。尽管研究多糖的立体构型有多种方法如电子衍射、旋光测定、核磁共振等，但X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合仍不失为当前确定多糖立体构型最为有力的工具等。
2、分子量分布研究
在审评中发现，仍有相当一部分多糖类成分的新药研究中没有对多糖的分子量分布进行研究。
从分子量分布情况，可以反映出多糖组分的纯度。对于杂多糖进行分子量分布进行研究，对控制多糖的质量具有重要的意义。因此有必要提供HPLC法测定多糖分子量及分子量分布的研究资料，并用多糖专用的色谱柱进行分析。
多糖的分子量分布分析方法较多如蒸气压法、端基法光散射法、粘度法、凝固点下降法、凝胶过滤法、高效液相色谱法、超过滤法等。2005年版中国药典二部中收载了高效液相色谱法，色谱柱为凝胶柱的分子量分布测定法。
3、鉴别方法研究
目前，多糖有效部位中药新药的质量标准中，对建立专属较强的鉴别方法研究甚少。多糖定性鉴别方法主要包括溶解性、硫酸咔唑反应(阳性)、蒽酮—硫酸试剂反应(阳性)、苯酚—硫酸试剂反应(阳性)、斐林试剂反应(还原糖试验)、双缩脲试验(阴性)、碘—碘化钾反应(阴性)、茚三酮反应(阴性)、三氯化铁反应、十六烷基三甲基溴化铵络合反应、比旋光度、特性粘度、电导率及PH值等。这些指标专属性不强，无法说明多糖的植物或动物来源。可以考虑通过采用药材对照及分子量分布HPLC凝胶色谱指纹图谱的建立来实现。
4、含量测定方法研究
多糖含量测定方法国内多采用显色试剂-硫酸法，根据单糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解，脱水生成糖醛类化合物，与酚类、芳胺类等缩合成有色化合物。如苯酚-硫酸法生成橙黄色溶液,在490nm处有特殊吸收，如红毛五加多糖、枸杞子多糖、石斛多糖等。蒽酮-硫酸法生成亮绿色溶液在620nm处有特征吸收，其蒽酮试剂需新鲜配制，如麦冬多糖、黄精多糖等。咔唑-硫酸法用于测定糖醛酸类多糖，如银耳多糖等。
国外有用LKB柱层析系统，用比旋度、示差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。
但以上测定方法应是在工艺中或样品前处理中通过透析或过凝胶柱等方法除去单糖、寡糖及小分子物质的前提下或在质量标准中增加单糖检查项，不得检出单糖的情况下是可行。
有的新药研究中将中性多糖和酸性多糖的含量相加说明有效成分的量符合有效部位的要求。但两类多糖的测定方法之间有干扰，因此结果的可靠性存在疑问。
中性糖的测定方法一般采用苯酚硫酸法或硫酸-蒽酮法以葡萄糖或以组成多糖的单糖中含量较高的单糖为对照进行测定；而酸性多糖一般采用硫酸咔唑法或联苯硫酸法以葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸为对照进行测定。中性多糖和酸性多糖往往在多糖提取过程中一并提出，文献报道酸性多糖对中性多糖的含量测定有干扰，而中性多糖对酸性多糖的测定亦有干扰，在确定有效部位总多糖含量时，除应减去单糖或寡糖的含量外，还应考虑酸性多糖和中性多糖两方法之间的相互干扰，并应考察干扰程度，分析是否可以忽略不计，以说明测定方法的可行性。
三、小结
1、目前多糖类有效部位的研究主要存在的问题是工艺研究中，没有进行分子量分布及药效跟踪研究，没有找到真正发挥疗效的有效多糖，说明有效部位为多糖的依据不足。质量控制方面，没有将关键的质控指标列入标准，如分子量分布、单糖检查等。尽管多糖的结构复杂，研究的难度大，并且多糖的结构测定有自身的难度和特殊性，给多糖的研究和临床应用带来了很大的限制。但仍应通过对多糖进行深入的研究，规范多糖的提取方法，说明多糖的构效关系以及多糖的组成与生物活性的相关性，来促进多糖研究的深入。
2、随着中药分析化学技术的进步和研究方法的不断丰富，在多糖类有效部位新药的研究中，应更多地采用先进的技术手段，以提高多糖类新药的质量控制水平。

超滤定义

从小鼠眼球取血得到的血清做ELISA，用双抗夹心法。然后一抗用的是来源于兔抗鼠的抗体，那么二抗应该抗兔还是抗鼠？傻傻分不清楚一抗应该是抗来源还是抗血清呀？（双抗夹心法）求大神指教

最全的ELISA试剂盒说明书在这里（通用版）

规格：96T 48T
用途：科研实验（仅供实验室研究使用）
保存：2-8℃。
有效期：6个月

结合物的制备
1. 戊二醛交联法
戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。
2. 过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。
结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
试剂盒组成

标本要求
1. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2. 加样
分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
操作程序总结：

计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射，以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
洗板方法：
1. 手工洗板方法：吸去或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
2. 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。待检样本：体液、血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆、心房水标本等

elisa抗原包被和抗体包被的区别
（一）包被用抗原

用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA试剂盒，在反应中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCVELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。
（二）ELISA试剂盒包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。展开

见到论坛上很多做蛋白纯化的小伙伴，经常在使用超滤技术的时候遇到各种相同的问题，反复的在版块上出现，根据自己的经验，我把此方面的内容整理一下，便于初学者以及遇到问题的小伙伴了解掌握。

如果大家有问题可以留言，咱们切磋交流，我没有将我在使用中的经验、教训一一罗列，更多的是将该技术相关的基础知识和背景进行了总结，因为我认为我们对任何一种技术的研究运用，都应当立足于其基础知识和背景来进行，而非“明知不可而为之”。

超滤（此处仅指用于蛋白样品处理的超滤技术）

定义：是以压力为推动力进行大分子和小分子分离的膜分离技术之一。

关键概念：截留分子量（MWCO），所有的膜分离技术均涉及的问题。其定义为：用已知分子量的球状物质进行测定。膜对被截留物质的截留率大于90%时，就用被截留物质的分子量表示膜的截留性能。以前参加研讨会的时候有老师称，一般大分子量90%截留，小分子量50%截留。与超滤有关的另一个概念是浓差极化，在膜分离过程中，大分子物质被膜所截留不断累积在膜表面上，使其在膜表面的浓度远高于其在主体溶液中的浓度，从而形成浓度差，并促使其反向主体溶液中扩散。一方面造成局部浓度过高，对蛋白本身的稳定性造成挑战，极易沉淀，另一方面对分离产生阻力，影响分离的成败和成本。

常见用途：去除盐类，浓缩样品

主要误区：经常有人认为或建议别人使用超滤技术进行两个不同大小分子量的蛋白分离，但几乎很少有人尝试成功过，即使成功了，也很难重复出来。仔细理解定义，我们可以看出超滤技术的局限性在哪里，关键词就在于：已知分子量的球状物质、截留率。这也是导致误区的所在。我们所拿到的标示10KD截留分子量的超滤装置，仅代表10KD球状蛋白可以很大概率的被截留在膜上面。定义中是进行的一个标准实验，实际使用中情况千差万别（我们的蛋白形状未必都是球状的，其他杂质存在干扰，膜及装置的差别等），所以不必太纠结这个MWCO的存在，参考而已。在使用时，一般会选择1/3目标蛋白分子量的超滤装置规格进行使用。以保证目标蛋白的浓缩。

常见超滤装置：

超滤是以压力为推动力的，常用的压力来源有使用惰性气体、离心力以及电驱动泵动力几种情况。我使用比较多的是下面的前两张图，左图是使用氮气罐进行正压超滤，可以进行搅拌，避免浓差极化，一般使用的压力为0.15-0.2MPa。过高的压力一方面超出装置的耐受，另一方面高压也容易引起蛋白质的失活变性。右图是不同规格的超滤管，搭配离心机进行使用，离心力一般几千g，不同厂家的有垂直的膜，也有水平的膜，我认为水平的效果稍好，使用这个装置的话，不可避免的损失比前者大（但其实每一种膜分离技术，损失都是不可避免的），我做过有时的损失会达到50%-70%，浓度越低损失越大。第三种是中空纤维浓缩，自动化程度可实现较高，处理样品的体积可以很大，可实现高倍浓缩，是其主要优势。

使用中常见注意事项：

超滤膜保存非常重要，不管使用哪一种装置，在使用后进行高盐+水清洗，以及低浓度乙醇保存，中空纤维的可以使用NaOH保存，尤其是前两种，膜一旦干了，就会导致孔径变化，或膜裂，无法继续使用；

不同蛋白最好不要混用超滤膜，非常容易引起交叉污染；

以上装置仅适用于澄清样品处理，浑浊样品会加剧膜孔径的堵塞和损坏；

使用过程中压力或离心力不要超出要求，以免损坏装饰；

一些超滤膜是分正反面的，即孔径分布呈梯度，也有一些超滤膜是不分正反面的，孔径均匀分布；

以上3种装置，我在使用中均遇到过蛋白沉淀的情况，因此蛋白质的稳定性问题需多考虑解决；

。。。。。。待补充

最近在了解学习免疫组化，很多问题不太明白，请问免疫组化如何正确选择和使用二抗呢？

现在皮包公司很多，你没有一定采购经验你是摸不准的，最简单方法就是你多问问身边人，借鉴他人经验