| 实验方法原理 | 选择纯化特异蛋白质的适宜染料一般是通过反复试验比较后决定。CibacronBlueF3GA，作为该领域的先驱染料与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸很相似，并且一直用于纯化激酶、水解酶、聚合酶和其他核苷酸依赖的蛋白质。但是这种结合特异性不是绝对的，CibacronBlue也用于不具有核苷酸结合功能的各种蛋白质的纯化。蛋白质与染料的结合可能涉及疏水、静电或氢键结合力等。 因此，尽管有市售的筛选各种染料的试剂盒，选择纯化给定蛋白质的最佳染料也没有现成的方法可楯。Scopes按照与蛋白质结合的能力将染料分类，并推荐了一个选择最有效染料的系统。 染料配基层析的操作比较简单。基于一些支持介质的染料层析柱填料可从市场获得，这些推荐的商品都有很好的可再生性。在选择适宜的染料配基时，非常实用的方法是连续进行几种染料配基层析试验，如果第一种不结合目的蛋白，也许第二种就会结合。洗脱时，绝大多数蛋白质是采用高盐方式洗脱，虽然后面还提及其他方法。染料配基柱若是与目的蛋白结合能力很有限，则可以降低溶液的pH值或应用二价、三价阳离子时常会得到改善。总之，遵循上述这样几个办法，染料配基层析 将在蛋白质纯化中发挥重要作用。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 蛋白质样品液 试剂、试剂盒 | Tris-HClNaClNaOHNaN3 仪器、耗材 | 层析柱 实验步骤 | 在开始染料配基层析纯化蛋白质之前，必须确定所用的染料。如前所述，需用不同染料柱进行小规模（1ml柱）试验筛选。Scopes推荐的策略可供参考。此外，进一步的小规模试验可用于优化洗脱参数。有必要提醒注意的是：一个能与许多蛋白质结合而不结合目的蛋白的染料配基柱非常有用。它可以作为最终纯化前去除杂蛋白的极佳步骤。以下介绍CibacronBlueF3GA柱用高盐溶液洗脫的方案。 1.用5mlCibacronBlueF3GA-琼脂糖装填一个层析柱。对大多数实际应用来讲，短而粗的柱子应能获得满意效果。长而细的柱子多用于纯化结合力弱的蛋白质，虽然流速会有所下降； 2.10倍柱床体积的层析缓冲液（例如，20mmol/L，pH8.0Tris-HCl，０.1mol/LNaCl）平衡装好的柱子； 3.为了达到上样要求，蛋白质样品液需转换成近似层析缓冲液的条件，即通过用层析缓冲液透析或1：1稀释来进行。上样前样品液应经离心或过滤达到澄淸。5ml柱子能上样50～200mg蛋白质样品。除非蛋白质结合容量非常高，通常上样蛋白质浓度应在10～20mg/ml范围； 4.上样到层析柱； 5.5倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线； 6.5倍柱床体积洗脱缓冲液（例如，20mmol/L，pH8.0Tris-HCl，0.1mol/LNaCl）洗脱目的蛋白； 7.检测洗脱组分中的目的蛋白，并汇集含活性目的蛋白的组分； 8.再生层析柱。先用3倍柱床体积1mmol/LNaOH洗柱，再用10倍体积含0.02％NaN3的层析缓冲液洗柱即可。 注意事项 | 其他 | |
