IgM抗体以难于纯化著称，因为它是以五聚体结构存在。要纯化IgM，需要结合盐析及IEC或者SEC的多步操作，这是纯化IgM的令人满意的手段，但是对于大量的抗体，这种方案过于繁琐且预期的产量低。在我们实验室，我们用两种其他的亲和柱纯化IgM—-蛋白质L亲和层析和山羊抗鼠IgM抗体亲和层析。

一、抗鼠IgM抗体亲和层析

我们实验室纯化IgM的首选技术是用山羊抗鼠IgM亲和层析柱。我们购买已经交联抗体的琼脂糖树脂并自己装柱。

二、试剂

结合缓冲液：l0mmol/L磷酸缓冲液含0.5mol/LNaCUpH7.2

2X结合缓冲液：2〇moL/L磷酸缓冲液含1mol/LNaCL,pH7.2

洗脱缓冲液：100mmol/L甘氨酸含150mmol/LNaCl，pH2.4

平衡缓冲液：I.〇mol/LTris

透析缓冲液：15mmol/LPBS溶液,pH7.6

柱子的准备可按照准备蛋白质A/G柱的程序。向干净的玻璃柱内倒人交联山羊抗一鼠IgM的琼脂糖树脂。当微珠沉淀后用结合缓冲液冲洗，用几个柱容的结合缓冲液清洗匀浆。当A28。监测器显示洗脱液吸光值达水平基线时，柱子便可随时使用。尽管任何来源的鼠IgM都可上柱，我们认为培养上清要好于腹水。当用腹水作为原材料时，可见到纯化的IgM有少量的白蛋白污染。如果没有选择，那么可能有必要用ffiC或者SEC进
行进一步纯化。

三、操作步骤

(1)用2X结合缓冲液I:1稀释澄清的抗体原液。只需准备当天要纯化的样本量。剩下的原液何时纯化何时稀释。

(2)第一次上样时，我们建议加过量的抗体原液。保留从柱中流出的废液，因为其中含有抗体。这种作法的目的是确定层析柱对你所需纯化IgM的最大结合量。

(3)上样后，收集并保留柱中流出的原液及第一次洗柱的液体。用结合缓冲液洗柱直到监测器返回基线为止。

(4)用洗脱缓冲液洗脱结合的抗体。将紫外分光光度计设置〇D=280mn，在此波长处测定洗脱下来的抗体量(参见「抗体浓度的测定」）。参考此浓度值，便可知道你制备的亲和柱的抗体结合量，以进行剩余的抗体纯化。

(5)根据对原液中所含抗体量的估计，依照先前的分离程序，将所有或者一部分收集的流出液重新上柱。

(6)用结合缓冲液洗去未结合的物质。当监测器返回基线时，直接洗脱抗体于Tris中和缓冲液中。

(7)当所有抗体洗脱完毕、监测器回复到基线，加结合缓冲液于柱内。当监测器达到基线时，柱子已准备好加入下一步的抗体原液。

(8)将洗脱下来并已中和过的抗体保存于4°C以便与再次纯化的IgM合并。

(9)继续上样并洗脱结合的抗体直到将所有抗体纯化完。

(10)集中所有洗脱抗体并对PBS溶液透析。抗体可进一步浓缩但IgM有易沉淀析出的倾向。我们建议以2〜5mg/ml的浓度保存最终的抗体。

用山羊抗鼠IgM亲和层析柱进行纯化的IgM抗体可用凝胶电泳[聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)或者等电聚焦（IEF)]来检测。在区带凝胶电泳上呈弥漫带型是大多数IgM单克隆抗体的典型特征。IgM是一个大分子，分子质量约750kDa,有大量的糖基化位点。拥有这些位点，一种IgM会有相当宽的电荷范围。从培养上清中纯化的IgM抗体将不含
腹水中鼠白蛋白的污染（图7.6)