| 实验方法原理 | 因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现其特异的噬菌体的存在，亦即噬菌体一般是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。虽然近年的研究表明，自由噬菌体颗粒可以独立的存活（当然不能生长），对自然条件有一定的耐受能力，又受到自然流动的散布，不一定总是和其宿主细菌同时存在，但没有宿主细菌的地方，其特异噬菌体的数量毕竟比较少。 由于噬菌体DNA（或RNA）侵入细菌细胞后进行复制、转录和一系列基因的表达并装配成噬菌体顆粒后，通过裂解宿主细胞或通过「挤出（exclude）」宿主细胞（宿主细胞不被杀死，如M13噬菌体）而释放出来。因此： 1.在液体培养基内可使混浊的菌悬液变为澄清或比较淸，此现象可指示有噬菌体存在；也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体； 2.在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被感染细菌的生长从而形成透明的或混浊的空斑，称噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体效价。 本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚分离出的噬菌体常不纯，如表现在噬菌斑的形态。大小不一致等，然后再作进一步纯化。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 大肠杆菌 试剂、试剂盒 | 装三倍浓缩的普通肉膏蛋白胨液体培养基试管液体培养基上层琼脂培养基底层琼脂平板 仪器、耗材 | 灭菌玻璃涂棒灭菌吸管无菌滤器（孔径0.22um）恒温水浴箱真空泵 实验步骤 | 1.噬菌体的分离 1.1制备菌悬液 37℃培养18h的大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。 1.2增殖培养 于100ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200ml与大肠杆菌悬液2ml，37℃振荡培养12～24h。 1.3制备裂解液 将以上混合培养液2500r/min离心15min。 将无菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，常规操作连接真空抽滤装置。将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液经37℃培养过夜，以作无菌检査。 液体抽滤完毕，应打开安全痕的放气阈增压后再真空泵，否则将产生滤液回流，污染真空泵。 1.4确证试验 经无菌检査没有细菌生长的滤液作进一步证实噬菌体的存在。 1.4.1于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂榉将菌液涂布成均匀的一薄层。 1.4.2待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，置37℃培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 2.1如已证明确有噬菌体存在，则用接种环取滤液一环接种于液体培养基内，再加入0.1ml大肠杆菌悬液，使混和。 2.2取上层琼脂培养基，溶化并冷却至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃水浴箱内备用），加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀。 2.3并立即倒入底层琼脂平板上，铺匀，置37℃培养24h。 2.4此法分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，需要进一步纯化，噬菌体纯化的操作比较简单，通常采用接种针（或无菌牙签）在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内，37℃培养。 2.5待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体， 以上2.1、2.2、2.3三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌试验的同时，由教师先做预备试验，若平板上的噬菌斑连成一片，则需减少接种量（少于一环）或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。 3.高效价噬菌体的制备 刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。 将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按1：10的比例混合，再加入大肠杆菌悬液适量（可与噬菌体滤液等量或1/2的量），培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到离效价的噬菌体制品。 注意事项 | 其他 | |
