实验方法原理 | |||||||||||
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实验材料 | PK-120 试剂、试剂盒 | Q-Sepharose树脂S-Sepharose树脂Hudroxyapatite羟基磷灰石SephacrylS-200凝胶赖氨酸内切酶乙腈三氯醋酸 仪器、耗材 | AppliedBiosystemsmodel477A气相蛋白质测定仪AppliedBiosystemsmodel120APTH分析仪反相高压也像系统uBondasphereS-5C8300A柱(2.1mm×150mm)TSK-GELODS-120T柱(4.6mm×150mm) 实验步骤 | 1.PK-120的纯化 1.1聚乙二醇组分制备 枸橼酸磷酸右旋糖杭凝人血浆500ml,使其含有1mol/LPMSF(蛋白酶抑制剂),0.1mg/mlpolybrene,100mmol/L赖氨酸,8mmol/LBaCl2,然后加入25g聚乙二醇4000(PEG),搅拌30min,6000r/min离心10min,离心沉淀溶于200ml含1mmol/PMSF,0.01mg/mlSBTl(大豆来源的胰蛋酶抑制剂),2ug/mlFUT-175,10mmol/L赖氨酸,20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4),以15%PEG再沉淀。6000r/min离心10min,以相同缓冲液300ml溶解沉淀,置4℃备用。以下柱层析操作中的缓冲液都含有上述蛋白酶抑制剂。 1.2Q-Sepharose柱层析 柱体积为4cm×27cm,预先用含10mmol/L赖氨酸20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡,将上述制备的血浆PEG组分上样,流速为190ml/h。先用500ml平衡缓冲液洗脱,洗去未吸附的杂蛋白,然后用含0.05~0.2mol/LNaCl的缓冲液(总体积为1000ml),线性洗脱,收集的各组分和PK(血浆激肽释放酶)在37℃下,温孵30min,进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色,被PK水解的120kDa蛋白为PK-120,制备抗体后,用双向免疫扩散法或免疫印迹法进行检测,从而鉴定含有PK-120的蛋白组分 1.3S-Sepharose柱层析 将上述得到的PK-120组分中加入PEG,终浓度达20%,用1mol/LHCl调pH至7.0,离心回收沉淀,用含10mmol/LEACA(氨基己酸、50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH6.0)溶解沉淀,预先用相同缓冲液平衡S-Sepharose柱(2.5cm×13.5cm),上样。充分冼脱,除去杂蛋白,用含0.025~0.03mol/LNaCl的缓冲液线性洗脱,流速170ml/h,PK-120的鉴定方法同上。 1.4HTP(羟基磷灰石)柱层析 用10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)平衡HTP柱(1.8cm×10cm)。PK-120组分上样,用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)洗脱,流速120ml/h。 1.5SepharylS-200凝胶过滤柱层析 上一步骤得到的PK-120组分,用Centriflomembrane(25kDacutoff;Amicon)浓缩,以含0.1mol/LNaCl,0.1%NaN3,50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡SepharylS-200柱(2.4cm×63cm)。上样,洗脱,流速20ml/h。由此得到的PK-120作为纯化样品供以下实验用。 2.分离纯化肽段及测定氨基酸序列 纯化的PK-120温孵,37℃30min(酶与底物的比例为1:50)。用0.1mol/LNaCl,Tris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡SepharylS-200柱(2.4cm×63cm)。上样。由PK水解PK-120产生的70kDa和35kDa分别来自PK-120的N末端和35kDa片段经赖氨酸内切酶水解测定的多肽序列C末端。由C末端来源的35kDa经吡啶乙基化(S-pyridyethylation)还原反应,再用赖氨酸内切酶水解,37℃,16h(酶与底物的比例1:50)。上样反相高压液相BondasphereS-5C8300A柱,流动相为水-乙腈-0.1%TFA,收集各组分,进一步上样方向高压液相TSK-GELODS-120T柱进行层析分离,收集洗脱各肽段,用AppliedBiosystemsmodel477A气相蛋白质自动测序仪/AppliedBiosystems120APTH分析仪以Edman降解法对分离肽段N末端进行氨基酸序列分析,结果如图所示。 注意事项 | 其他 | |