DEAESephadexA50柱层析纯化免疫球蛋白
实验方法原理 | DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将CL-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。在PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。 | ||||||||
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实验材料 | γ球蛋白 试剂、试剂盒 | NaOHHClNaClNaN3DEAE-SephadexA-50PEGPB 仪器、耗材 | 层析玻璃柱滴定铁架自由夹螺旋夹尼龙纱冰箱紫外分光光度计电导仪抽滤装置pH计透析袋座标纸滤纸PH试纸量筒烧杯试管吸管滴管灭菌小瓶 实验步骤 | 1. 称DEAE-SephadexA-50(下称A-50)5克,悬于500ml蒸馏水,1小时后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5NNaOH15ml的比例,将A-50浸泡于0.5NNaOH中,搅匀,静置30分钟,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性;再以0.5NHCl同上操作过程处理,最后以0.5NNaOH再处理一次。处理完后,将A-50浸泡于0.1M,PH7.4PB中过夜。 2. 装柱 (1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上,柱底垫一园尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 (2)将0.1M,PH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。待A-50凝胶沉降2-3cm厚时,启开出水口螺旋夹,控制流速1ml/分钟,同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。 (3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后,柱面放一园形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口,通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3. 平衡 启开出水口螺旋夹,控制流速12-14滴/分钟,使约2倍床体积的洗脱液流出。并以PH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同。达到一致时关闭出水口,停止平衡。 4. 加样及洗脱 启开上口橡皮塞及下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2%,蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内,至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2-3次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数ml洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12~14滴/分钟。 5. 收集 开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。 6. 测蛋白 以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm,与OD260nm,按前述公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标,以试管编号为横座标,绘制洗脱曲线。 7. 合并、浓缩 将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以PEG(MW6000)洗缩至所需体积,加入0.02%NaN3防腐剂,于4℃保存备用。 8. A-50凝胶的再生 在柱上先以2MNaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时,以无水酒精洗2次,再置50℃温箱烘干,装瓶内保存。 注意事项 | 1. 柱的选择 从理论上说,只要柱足够长,就得获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱的直径增加,使液体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。 2. 纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析。 3. 所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。 4. 洗脱过程中应严格控制流速,且勿过快。 5. 上样的体积要小,浓度不宜过高。 6. 加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。 |
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发布于 : 2021-08-17
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