一、用于RP-HPLC纯化的大分子非极性多肽或蛋白质样品的制备

1.将多肽样品（如果蛋白质是通过固相化学合成法得到的，质量在30~50mg之间，尽管其量低至mg级，方法与其他来源的蛋白相似）在微量离心管中用洗脱液溶解（使用溶液B，如果样品在30~50mg之间，则应用1ml溶液B来溶解；如样品量更少，则相应减少溶液B的用量）。

根据多肽或蛋白的疏水性，如疏水性较大，则应提高缓冲液中乙腈的浓度，一般含有0.1%TFA的60%乙腈水溶液可以满足要求。对可溶性很差的多肽，则需使用含有0.1%TFA的90%乙腈水溶液，或许也必须使用去垢剂、脲、盐酸胍或60%甲酸溶液。详细研究表明（Heam，1991a)，对于RP-HPLC中所用的许多大分子量多肤或小蛋白，溶解的最佳TFA浓度一般为25mmol/L。

2.用微量离心机离心粗提样品，2000g离心5min，确保所有不溶物和沉淀在上样則全部被除去。

方案4、方案5、方案6中给出了一些附加的实验程序，这些实验程序可获得相当高的分辨率。

二、大分子量非极性多肽和蛋白的分析

分析只需少量的样品（50ul)。

1.采用不同型号的RP-HPLC吸附剂，在不同洗脱条件下，准备5~10份样品来评估分离条件（如不同的流速、温度或梯度斜率参数）。

2.每次进样约为5ul。

三、大分子量非极性多肽或蛋白的纯化

1.在每个盛缓冲液的容器中以100ml/min的速度通氮气20min。

该步骤的目的是除去所有气泡，防止其进人HPLC体系。当体系在运打时，氣气的速度可减小到20ml/min。

在整个HPLC体系中，保证没有气泡是很重要的。系统中的气泡将导致缓冲液流速的不稳定。如果用新配置的缓冲液灌满所有管道，则泵的压力传感器应该指示稳定的柱后压。在连接好层析柱以前，每个泵抽取一些缓冲液，从而可在出口处检查流速的稳定性。

2.接好色谱柱，先用洗脱液以6ml/min的流速洗15min，以确保除去层析柱中的杂质，然后就可以加样了。

3.启动数据采集软件，检查检测器是否被校准到所需波长。

对于含有芳香侧链氨基酸的多肽可用254nm的波长，其他情况则可用230nm波长。配有光电二极管阵列检测器为获得不同的、衍生的、较髙阶的谱线以及有效的峰轨迹跟踪算法提供了灵活的选择。

4.在电脑上设置溶剂洗脱梯度。

一般使用60mm内梯度变化为2%?98%的缓冲液B。通常在分离邻近的峰时采用非常平缓的梯度。

5.保持上样缓冲液A的流速在6ml/min，用手动加样器上样。

6.当出现多重峰时（通过色谱的高吸收值），在试管中收集小片段（1~2ul)作进一步分析。如图5.11所示。

7.将收集到的组分分装到样品管中，以进行下面的分析，包括RP-HPLC、高效毛细管电泳（HPCZE)、毛细管电色谱（CEC)或质谱（ESI-MS或MALDI-MS)等，这些分析步骤可以常规实施。一般而言，每个样品应保留50ul用于评估峰纯度等，而一次进样30ul通常可满足所有的分析需要。

8.如对收集到的组分进行RP-HPLC分析，要重复步骤①?⑥来准备HPLC体系，但应以稳定的分析柱代替预制柱，并将流速降低到1ml/min，在波长为214nm处进行检测。

如要进行快速分析分离，分析时洗脱时间可缩短到25min，重新平衡的时间为10~15min，以确保系统为下一次分析作好准备。

9.当制备好分析所用的组分时，就可以将样品置于管中，在冷冻干燥机上冻干样品过夜。