免疫球蛋白 M(IgM)和免疫球蛋白 D(IgD) 的纯化 实验方法
| 实验步骤 | 基本方案1用透析和凝胶过滤层析法纯化IgM此法纯化的IgM可达到较好纯度，可用于酶解、异硫氰酸盐荧光素（FITC)标记、生物素标记或放射性标记。 材料（带V项目见附录1)腹水或单克隆抗体（MAb)上清（单元1.4) PBS Sorvall离心机，SS-34型转子（或类似转子） 26mmX900mm层析柱，填有适当凝胶过滤（SE)树脂（CPI附录31) 1.单元L5离心和去除IgG中脂类物质的方法纯化腹水上清，若是MAb上清，室温或4℃，15000g离心30min，去除细胞碎片，保留上清。 2.将澄清的腹水或MAb上清转至透析袋中，在4°C下用≥10倍样品体积的蒸镏水透析24h，在室温或4°C下将透析好的溶液以15000〜20OOOg离心lh，弃去上清。 3.将填有SE树脂的26mmX900mm层析柱用PBS平衡（CPI附录31)，用≤5mlPBS溶解步骤2中的沉淀并上样，用PBS洗脱蛋白质并收集100个组分（1%柱体积）。 4.测A280。值确定IgM浓度（表1.5.1)。将含有纯IgM的洗脱液合并（第一个洗脱峰）。用10%SDS还原聚丙烯酰胺凝胶鉴定IgM纯度（单元12.3)。视使用的凝胶装置而定上样量，为1〜80ul。电泳上IgM显示二条带，在78kDa处的重链带和25kDa处的轻链带。 5.溶于PBS中浓度为1〜20mg/ml的IgM可于4°C或一70°C(不能冻融）保存数月，若IgM出现沉淀，可用更髙离子浓度的缓冲液再溶解（如加入NaCl)。 |
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发布于 ： 2021-08-29
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