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重组杆状病毒的纯化实验 实验方法
来自 : 蚂蚁淘
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 制备病毒上清的系列稀释液,该病毒上清获得自在无血清完全培养液中转染pAC360β-galDNA的细胞。在含150μg/mlX-gal 的琼脂糖顶层覆盖物下病毒形成蚀斑。
 
2. 当蚀斑形成后,用灭菌巴斯德吸管挑取一个分离较好的蓝色蚀斑,并将琼脂糖块移入一支含有1ml无血清完全培养液的无菌试管中。在旋涡混合器上剧烈篱荡,并用无血清完全培养液制备10-1、10-2和10-3的系列稀释液。
 
3. 用含150μg/mlX-gal 的琼脂糖顶层覆盖物蚀斑测定病毒(有助于发现重组子),重复蚀斑试验,直到获得纯的重组病毒贮液。
 
4. 用无菌吸管挑取一个纯的重组蚀斑,将琼脂糖块移入一含2.5×106Sf9细胞和5ml完全培养液(含10%胎牛血清)的25cm2培养瓶中。于27℃温育4~5天直到大多数细胞被感染。
 
5. 确定病毒滴度(应在5×107~1×108 pfu/ml之间)。
 
6. 加入1ml该毒种贮液于一支1.5ml螺口冻存管中,于-80℃可长期保存,于4℃保存剩余的液体(标记为初代毒种液)。从初代毒种液中生产大批病毒贮液并滴定之。
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