| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 高滴度的Acf1－FLAG和ISWI杆状病毒储液晚对数期的悬浮培养的Sf9细胞 试剂、试剂盒 | 公磷酸缓冲盐溶液（PBS）裂解缓冲液FFLAG-M2树脂1：1（VV）悬浮液（Sigma－Aldrich）稀释缓冲液F洗涤缓冲液F洗脱缓冲液F液氮牛血清白蛋白（BSA）标准 仪器、耗材 | 锥形离心瓶Wheaton杜恩斯匀浆器A型研磨棒SorvallSuperspeed离心机 实验步骤 | 1.杆状病毒储液在感染前扩增几天。 为扩增病毒，Sf9细胞以2×107细胞/皿植于150培养皿上，加入适当的有血清的培养液至25ml，并且以感染重数（MOD为0.1～0.5（每盘细胞加入10～20ul病毒悬液）进行感染。为了获得病毒的储液储存，感染60h并在无菌条件下收集培养液上清。对于高滴度的储液（将进一步用于表达感染），感染可以进行到细胞发生裂解为止（His－NAP－1病毒约72h，ISWI和Acf1－FLAG约84h）。这一过程产生的病毒储液的滴度接近或高于每毫升109pfu。在无菌条件下吸出皿中的培养液，于4℃避光保存在50ml管中至少12个月，并且不会丧失明显的滴度。 2.以0.5×106细胞/ml接种SF9细胞至150～500ml旋转式培养瓶中，并生长2～3天。将SF9细胞按照2.5×107～3×107细胞/皿分到5～25个平皿中，每皿加入适当的昆虫培养基至25ml。在组织培养箱中放置20min，使细胞沉降，用重组的Acfl－FLAG和ISWI杆状病毒以MOI为5～10感染细胞。 3.感染44～46h后，吸出培养液并用10ml冰冷的PBS每皿将细胞冲洗下来。在250ml锥形瓶或50ml管子中使用临床离心机4℃，2000r/min离心5min。 4.在冷室或于冰上操作，用8ml裂解缓冲液F重悬细胞，用Wheaton杜恩斯匀浆器破碎细胞（使用A型研磨棒；于冰上，在30min内，10次匀浆进行3遍）。 5.4℃，在14ml—次性锥形离心管中14500g（SS－34转子11000r/min）离心10min沉淀不溶物。在上清液中加入250FLAG－M2树脂（经裂解缓冲液F平衡的1：1的悬浮液）和7ml稀释缓冲液F。混合液在15ml带盖聚丙烯管中4℃于摇床上混匀3～4h。 6.洗涤树脂4次，每次使用12ml洗涤缓冲液F，接着于4℃，在临床离心机上2000r/min离心3min，吸去上清并重悬。 7.按如下步骤洗脱蛋白质： 7.1在步骤6的树脂沉淀中加入100洗脱缓冲液F重悬树脂。 7.2将树脂转移到1.5ml硅烷化的微量离心管中。 7.3冰浴10min。 7.4以最大转速离心30S。 7.5将上清转移到另一个管子中（与下一步的洗脱液混合）。 7.6继续在同一个硅烷化的微量离心管中再重复步骤7.1、7.3、7.4、7.53次，将所有的洗脱液混合到一起。 8.将蛋白质分装（每管20～50），用液氮速冻并于-80℃保存。 9.可选：将蛋白质与一系列标准浓度的BSA同时进行SDS-PAGE电泳，并进行考马斯亮蓝R－250染色，以估计蛋白质的浓度。 注意事项 | 其他 | |
