Optimized,completesystemforproductionoffull-lengthCDNAfromlowamountsoftotalRNA.
Synthesizefull-lengthcDNA(>15kb)- Generatefirst-strandcDNAfrompicogramamountsoftotalRNA
- Selectolido(dT)orrandomprimers-bothincluded
Applications
- First-strandcDNAsynthesisforsubsequentPCRorreal-timePCR.
- RT-PCRvalidationofgeneexpressiondataobtainedfrommicroarrayexperiments.
- RT-PCRvalidationandquantificationofgenesilencingbyRNAinterference.
TheMMLVReverseTranscriptase1st-StrandcDNASynthesisKitproducesfull-lengthfirst-strandcDNAfromtotalcellularRNApreparationsorpurifiedpoly(A)RNA.
ThiscompletekitincludesthesameMMLVHighPerformanceReverseTransciptasethatisavailableasaseparatecomponent(Cat.No.RT80125K)andmaintainsallthesamehighperformancecharacteristicsasthatstandaloneenzyme.TohelpsimplifyyourcDNAsynthesis,thiskitcontainsallthenecessarycomponentstomake1ststrandcDNA.
Benefits
- Synthesizefull-lengthcDNAfromRNAtemplateslongerthan15kb.
- MMLVHPRTdemonstratessignificantlyhigheractivitythancompetitivereversetranscriptaseenzymes.
- ReactionBuffer,optimizedforproducingfull-lengthcDNA,isincludedwithboththeMMLVHPRTandtheMMLVReverseTranscriptase1st-StrandcDNASynthesisKit.
- Thekitincludesbothanoligo(dT)andrandomnonamerprimers.
- First-strandcDNAcanbemadefrompicogramamountsofinputtotalRNA.
- ThekitincludesapotentRNaseInhibitortoprotecttheintegrityoftemplateRNA.
Figure1.MMLVHPRTproducesfull-lengthcDNAfrommRNAlongerthan15kb.TotalRNAisolatedfromHeLacellswasreversetranscribedandthecDNAwasamplifiedbyPCR.Detectionofthe1.3-kbPCRampliconfromnearthe5´endofthemRNAdemonstratesfull-lengthreversetranscriptionofHERC1mRNA(A).AgarosegelanalysisofthePCRproductsshowsthe1.3-kbampliconfromthe5´endofthemRNA(B).LaneM,100bpDNAladder;lane1,no-RTcontrolreaction;lane2,PCRproductfromcDNAsynthesizedbyEpicentre'sMMLVHPRT.
| TargetTranscript(Size) | 3´/5´Ratios | ||
| EpicentreMMLVHighPerformanceReverseTranscriptase | CompetitorI(RNaseH-MutantofMMLVRT) | CompetitorP(MMLVRT) | |
| ACTB(1,792b) | 0.9 | 1.7 | 1.2 |
| GUSB(2,162b) | 1.0 | 6.1 | 2.5 |
| TFRC(5,010b) | 5.5 | 12.1 | 11.3 |
Table1.3´/5´ratioanalysisofcDNAproducedbydifferentreversetranscriptaseenzymes.TotalcellularRNAfromHeLacellswasconvertedtocDNAusingthethreereversetranscriptaseenzymesindicatedinthetable.A3´/5´ratioequalto1.0meansthatequalamountsofPCRproductsareobtainedfromboththe3´and5´endofthecDNAandthereforeisagoodindicationthatthereversetranscriptasehasproducedafull-lengthcDNAcopyofthemRNA.
2A.
Figure2.cDNAproducedbyEpicentre'sMMLVHighPerformanceReverseTranscriptaseyieldsasignificantlyimproved3´/5´ratiothancompetitivereversetranscriptases.Theapproximately2160-baseHeLaβ-glucuronidasemRNA(GUSB)wasreversetranscribedintocDNAusingEpicentre'sMMLVHighPerfomanceReverseTranscriptaseandtwocompetitivereversetranscriptaseenzymes.PCRprimerpairstothe3´-endand5´-endofGUSBcDNAweresynthesizedandqPCR(SYBR®GreenIdyedetection)wasperformedusingeachprimerpairandtheGUSBcDNAsastemplates.The3´/5´ratiowascalculatedforeachasdescribedinthetext.(A).PCRampliconsfromthe3´endand5´endoftheGUSBcDNA.(B).qPCRquantificationgraphsfordetectingthe3´ampliconand5´ampliconofGUSBcDNAproducedbyEpicentre'sMMLVHighPerformanceReverseTranscriptaseKitandtwoothercommerciallyavailablereversetranscriptaseenzymes.
| 5'-amplicon | |
| 3'-amplicon |
2B.
EpicentreMMLV1st-StrandcDNASynthesisKit
CompanyIRNaseH-minusMMLVRT
CompanyPMMLVRT
ORDERINFORMATION
MMLVReverseTranscriptase,10XReactionBuffer,RiboGuard™RNaseInhibitor,dNTPPreMix,DTT,Oligo(dT)21Primer,Random9-merPrimers,RNase-freeWater.ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
用,靠.规模析文库克隆.
1)同源探针:至少含所需cDNA克隆部确切序列.用于部克隆离cDNA文库全克隆.
2)部同源探针:探针序列与所要筛选cDNA克隆序列相关相同.用于克隆家族基.
3)总cDNA探针:
通反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通总或级离poly(A)+mRNA进行末端标记获cDNA探针.
cDNA扣除探针:
第种mRNA制备cDNA探 针, 连续与20倍量第二种mRNA杂交;
收未杂交cDNA探针, 再与100倍量第种mRNA杂交, 使原mRNA些特异序列高度富集.
* 主要用于探测cDNA文库与调节水平所差别mRNA克隆.
5)合寡核苷酸探针
2 特异性免疫检测
cDNA表达文库,目基表达产 物能与特异性抗体发免疫反应,通酶加检测
3 cDNA克隆同胞检测
cDNA文库若干组含10-100克隆易于处理亚cDNA文库,每组亚cDNA文库进行检测,鉴定阳性库再断其更细库进行检测,直获阳性单克隆.
4 cDNA克隆确证
cDNA克隆含编码某特定蛋白质完整氨基酸序列放读框.
第四节 目基离
外源基:
插入载体内特定片段基.
目基:
些已或者准备要离,改造,扩增或表达特定基或DNA片段.图" class="ikqb_img_alink">
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
二、 DNA文库和cDNA文库的构建原理
DNA文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
三、DNA文库和cDNA文库的用途
基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA展开
①些物,RNA病毒没DNA,能用cDNA克隆；
②cDNA克隆易筛选,cDNA库包含非结构基克隆,且每cDNA克隆含mRNA信息；
③cDNA能细菌表达.cDNA仅代表某发育阶段表达遗传信息,基文库才包含物完整遗传信息.
cDNA是DNA转录成RNA再逆转录获得的，而在转录时，原DNA上的内含子和非编码区都会被加工切掉，只剩下原DNA编码区上的外显子对应的RNA片段，再逆转录的话，得到的cDNA就跟原DNA不同了。
所以要基因组测序，提供cDNA文库是不够的
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA
基因组文库
用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。展开
