【求助】使用cDNA文库扩增基因
2021-08-12
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mpark
用户
You can do cDNA library amplification, but try to grow bacterial colonies on LB-agar plates. If you have to grow cDNA library bacterial cultures in LB liquid, grow less than 6 hours.
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xiejiazhen
用户mparkYoucandoCDNAlibraryamplification,buttrytogrowbacterialcoloniesonLB-agarplates.IfyouhavetogrowcDNAlibrarybacterialculturesinLBliquid,growlessthan6hours.为什么要在平板上长，而不能直接像普通菌种一样液体过夜培养呢？我看了相关文库扩增的办法，也是先将含有10e6个克隆左右的文库用培养基稀释后涂布在平板上，待平板长好后，再用培养基洗下来。请问有什么蹊跷吗？
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xyq641160
用户不会不完整的，CDNa本身就是随机分布的，并且你听说过单拷贝mrna么？
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xyq641160
用户做文库的目的是挑出单克隆然后送去测序，全部混在一块你怎么得到你要的东西，不如直接让公司给你做这些
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xiejiazhen
用户xyq641160不会不完整的，CDNa本身就是随机分布的，并且你听说过单拷贝mrna么？原来的cdna文库是实验室前人请公司构建的。我看了文库报告：总克隆数CFU=7.12×105cfu/ml×5ml=3.56×106我的理解是一共有5ml，总共有3.56e6的克隆。我的担心是：如果我吸了100微升出来扩大培养，也只有7.12e4克隆，而且这部分克隆分导致保存的cdna文库克隆减少。而且这7.12e4克隆里面不一定有我要的基因。不知道我的理解和担心是否正确呢？
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xyq641160
用户你要扩基因的话，应该是race吧，哪用得了100u,1u就够用了，还有你吸出来的一般不会影响整个文库的，这样理解基因在文库中是均匀分布的，并不是随机分布，建议楼主好好提一次rna，好好分析一下失败原因
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xiejiazhen
用户xyq641160你要扩基因的话，应该是race吧，哪用得了100u,1u就够用了，还有你吸出来的一般不会影响整个文库的，这样理解基因在文库中是均匀分布的，并不是随机分布，建议楼主好好提一次rna，好好分析一下失败原因1u是不是不行啊，根据文库报告，1u克隆数CFU=7.12×105cfu/mlx1u=712，这712个克隆里含有我需要基因的机率很小啊。
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xyq641160
用户老大，你们实验室有师兄师姐不，他们的论文看过没有还有race的说明书看过没，你对之后的实验有没有大致的概念，要怎样获得你的目的基因，用什么手段
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xyq641160
用户我之前做这个的时候也有这种情况，弥散在我看来有两种情况，第一，pcr程序设计的问题，Tm不合适，pcr轮数太高，解决方法是提高退火，适当减少循环。第二里面根本没有你想要的东西或者CDNa浓度太高，直接用原液pcr经常就会出这种结果
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xyq641160
用户看看实验室之前的文章，这个技术如果在实验室比较成熟，就去请教老师或者师兄师姐，看看师兄师姐的是实验录本，这个涉及到实验室的传承问题
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xiejiazhen
用户xyq641160老大，你们实验室有师兄师姐不，他们的论文看过没有还有race的说明书看过没，你对之后的实验有没有大致的概念，要怎样获得你的目的基因，用什么手段RACE已经成功了，就是全长拿不到。我们实验室刚刚开始做动物这一块，获取目的基因现在是瓶颈。
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