Anovelhigh-temperatureOneStepRT-PCRkitbasedonthecombinationofSunScript™ReverseTranscriptaseRNaseH-andhigh-qualityTaqPolymeraseforthereversetranscriptionandPCRamplificationofspecificRNAfragmentsinoneconvenientsinglestep.
- ImprovedthermalstABIlityforthereversetranscriptionstep: Worksupto85°C(60-65°Crecommended).
- TranscriptionandamplificationofdifficultRNAs:TranscribesRNAswithhighGCcontentorcomplexsecondarystructures.
- Greatsensitivity: StartswithpicogramamountsofRNA
- ImprovedPCRspecificity:HotstartTaqpolymerasegreatlyimprovesspecificityduringamplification
- HighyieldsofamplifiedDNA
- Highreproducibilityacrossreactions: Bestchoiceforprocessingmultiplesampleswithminimumdeviations.
- Easyhandling: Reagentsareaddedinasinglestep,whichalsominimizesdangersofcontaminationandreducesoverallhandlingtime.
TheSunScript™OneStepRT-PCRKitisaneasyandreliablesystemdesignedforfast,specificandsensitiveendpointRT-PCRreactions.ThiskitcontainsallthecomponentsneededtoperformbothreversetranscriptionandPCRamplificationinasingletubebyusinggenespecificprimersina“onestep”reaction.Thisminimizescontaminationsandconstitutesaconvenientsystemtoprocessmultiplesamples.
- OneStepRT-PCRProtocolOverview
- DetectionofmRNAswithdifferentexpressionlevels
- HighthermalactivityoftheRTstep
- Highsensitivity
- Highreproducibility
- AmplificationanddetectionofdifficultRNAtargets
OneStepRT-PCRProtocolOverview
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DetectionofmRNAswithdifferentexpressionlevels
100ngoftotalRNAfromHeLacellswerereversetranscribedandamplifiedwithSunScript™OneStepRT-PCRKitandspecificprimersfortheindicatedgenes(GAPDH,HERCGUSB,CLTCandACTIN).
Thekiteasilydetectsgeneswithvastlydifferentexpressionlevels.
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HighthermalactivityoftheRTstep
100ngoftotalRNAfromHeLacellswerereversetranscribedandamplifiedwithSunScript™OneStepRT-PCRKitandspecificprimersfortheGAPDHopenreADIngframe(productlength305bp).
TheRTreactioncanbeperformedattemperaturesupto85°C,makingthisthebestchoicefordetectingdifficultRNAs,withhighdegreesofsecondarystructure.
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Highsensitivity
TheindicatedamountsoftotalRNAfromHeLacellswerereversetranscribedandamplifiedwithSunScript™OneStepRT-PCRKitandspecificprimersforGAPDHCDNA(productlength305bp).
ThesensitivityofthekitisgoodenoughtodetectexpressedgenesfromtotalRNAstartingmaterialintheorderofpicograms.
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Highreproducibility
100ngoftotalRNAfromHeLacellswerereversetranscribedandamplifiedwithSunScript™OneStepRT-PCRKitandspecificprimersfortheindicatedgenes(4replicatesareperformedpergene).
Thefourindependentreplicatespergeneshowsimilarsensitivityandyield,makingthiskitthebestchoiceforprocessingmultiplesampleswithminimumdeviations.
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AmplificationanddetectionofdifficultRNAtargets
100ngoftotalRNAfromHeLacellswerereversetranscribedandamplifiedwithSunScript™RT-PCRKitandfourdifferentspecificprimerpairsforafragmentoftheTAFII100cDNAwith75%GCcontent(productlengths430-470bp).
TheRT-PCRprotocolwithsampledenaturationwasperformedhereandthecDNAsynthesisstepwasperformedat60°C.
ThefouroligopairsproducedeffectiveamplificationbandsdespitetheelevatedGCcontentofthetemplateRNA.
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ORDERINFORMATION
EachSunScript™OneStepRT-PCRKitcontains:EnzymeMix,2XReactionBufferandwater.ThecompletemanualisavailableundertheManualtab.LucigenisanauthorizeddistributorofSygnisproductsintheUS.
SunScript™OneStepRT-PCRKitisintendedformolecularBIOLOGyuseonlyandinvitrouseonly.Thisproductisnotintendedfordiagnosis,preventionortreatmentofadiseaseinhumanbeingsoranimals.
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基因表达谱指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库,大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就称为基因表达谱。
基因组文库是一个比较笼统的概念。这个文库可以指某种真核生物的基因组，也可以指某种原核生物的基因组。实质是将某种生物的全部遗传信息贮存在一个受体菌群体中，做为目的基因的来源。
限制性内切酶：酶切目的基因和载体，使其产生相同的粘性末端。
DNA连接酶：连接目的基因和载体。
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA
基因组文库
用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。展开
基因组酶切后，切胶回收浓度大概为多少才可以进行下一步实验？为什么二十几的浓度和载体连不上呢？载体也明明去磷酸化了，单连载体的时候也不会自连。那为什么把载体和酶切后的基因组连起来转化后挑菌做PCR验证却有很多空载呢？我的基因组酶切大小为2kb~4kb。上面那排7kb~10kb的带是什么东西呢？
MicroRNA（miRNA,微RNA）：即为长度为22nt左右的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。
小的干涉RNA（siRNA）：是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。
miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。4.二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。5.miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。
miRNA与siRNA的不同点：1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
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