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제품특징
□ 제품설명
본 제품은 Mycoplasma 16S rRNA 유전자를 타겟으로 Real Time PCR 장치를 이용해대부분의 Mycoplasma를 특이적으로 검출하기 위한 kit이다. 적어도 Mycoplasma 속 중의 10종(M. arginini, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale, M. salivarium, M. fermentas, M. bovis, M. arthritidis, M. pirum, M. pneumoniae) 및 Acholeplasma속 중의 1종(A. laidlawii)에 대해 매우 민감하게 검출할 수 있음을 확인하였다. 본 kit의 증폭 반응에는 Hot Start PCR용 효소인 TaKaRa Ex Taq HS를 사용하고 있어 반응액 조제 혹은 반응(본격적인 cycle 반응)전에 miss-priming이나 primer dimer에서 유래하는 비특이적 증폭을 막을 수 있다. 증폭 산물의 검출에는 cycling probe법을 사용하고 있다. 이 방법은 RNA와 DNA로 구성된 키메라probe(chimera probe)와 RNase H와의 조합에 의한 고감도 검출 방법으로, 매우 특이성이 높은 검출이 가능하다. Probe는 한쪽 말단은 형광 물질로, 다른 말단은 그 형광 물질이 발하는 형광을 소광하는 물질(quencher)로 표지되어 있다. 이 cycling probe는 intact한 상태에서는 quenching에 의해 형광을 발할 수 없지만, 상보적인 증폭 산물과 하이브리드를 형성한 후에 RNase H에 의해 RNA 부분에서 절단되면, 강한 형광을 발하게 된다. 이러한 방법으로 형광 강도를 측정하여 증폭 산물량을 모니터 할 수 있다. 본 kit의 probe는 Mycoplasma에 특징적인 염기에 상보적으로 결합 하는 염기 부분을 RNA로 하고 있기 때문에, Mycoplasma만을 특이적으로 고감도에 검출하는 것이 가능하다.
□ 내용
1. 2×CycleavePCR Reaction Mix | 625 μl |
2. Myco. Primer/Probe Mix(5×conc.) | 250 μl *1 |
3. RNase Free dH2O | 1 ml |
4. Myco. Positive Control(1×106 copies/μl) | 20 μl *2 |
5. Proteinase k | 50 μl |
*1 형광 표지 probe를 포함하고 있으므로 차광에 유의한다. *2 Real time PCR component (1~3)에 잘못해 혼입하면 올바른 검출 반응을 실시할 수 없게 된다. 별도의 보관케이스를 마련하여 따로 보존한다.
□ 보존
- 20℃
□ kit 이외에 필요한 기기, 시약
* Real Time PCR용 증폭 장치 및 전용 튜브 Thermal Cycler Dice Real Time System II(TP900/TP960) Thermal Cycler Dice Real Time System Lite(TP700/TP760)해석에는 Thermal Cycler Dice Real Time System Software Ver.4.0을 사용.Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(Life Technologies) * 200 μl, 20 μl, 10 μl 각 micropipette, tips* 탁상원심기 등
□ Positive Control에 대해
Mycoplasma Positive Control을 주형으로 Mycoplasma Primer로 증폭된 PCR 산물은, FAM 표지 probe 검출 영역과 ROX 표지 probe 검출 영역의 양쪽 모두를 포함하고,FAM 표지 probe와 ROX 표지 probe 모두에서 검출된다. 샘플 중에 저해 물질이 포함되어 있는지 어떤지를 확인하기 위해서는 사용하는 샘플에 Mycoplasma Positive Control를첨가하고 Control 실험을 실시해 ROX 필터로 검출의 유무를 확인한다.ebiomall.com
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CDNASizeFractionation做完后的电泳检测,发现条带的大小都在5000bp左右,感觉是哪里有问题。前面步骤检测很好。不知道有问题没有?请哪位高人指点一下。
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库,它包含了该生物的所有基因。
以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
二、 DNA文库和cDNA文库的构建原理
DNA文库:用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA,可以得到大量的基因组DNA片段,然后将这些DNA片段与载体连接,再转化到细菌中去,让宿主菌长成克隆。这样,一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
cDNA文库:以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
三、DNA文库和cDNA文库的用途
基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA展开
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已经在mirbase数据库下载水稻的所有miRNA序列,可以比对某种昆虫的转录组文库寻找靶基因吗?
可以用targetscan或者miRwalk网站吗?有什么方法吗?
基因表达谱指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库,大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息,这样编制成的数据表就称为基因表达谱。