96-well Cell Adhesion Assay
(Fibronectin Coated, Fluorometric Assay)
Catalog Number: ECM-1023 96 assays
Storage: Upon arrival store the components at 4C.
Introduction: Due to its diverse nature and composition, the ECM can serve many functions, such as providing support and anchorage for cells, segregating tissues from one another, and regulating intercellular communication. The ECM regulates a cell"s dynamic behavior. In addition, it sequesters a wide range of cellular growth factors, and acts as a local depot for them. Changes in physiological conditions can trigger protease activities that cause local release of such depots. This allows the rapid and local growth factor-mediated activation of cellular functions, without de novo synthesis.
Formation of the extracellular matrix is essential for processes like growth, wound healing and fibrosis. An understanding of ECM structure and composition also helps in comprehending the complex dynamics of tumor invasion and metastasis in cancer biology as metastasis often involves the destruction of extracellular matrix by enzymes such as serine and Threonine proteases and Matrix metalloproteinase.
Biopioneer 96-well Cell Adhesion Microplate Assays are designed for the determination of the relative attachment of adherent cell lines to extracellular matrix proteins such as clooagen I, collagen IV, Firbronectin and vitronectin.
Principle of the assay
BioPioneer 96-well Cell Adhesion Assays are designed for the determination of cell attachment to ECM proteins. After incubation followed by a brief wash step, attached cells are quantified with fluorescent dye. BSA-coated wells serve as a negative control, and poly-L-lysine-coated wells serve as a positive control for general attachment.
Materials Provided
1. Fibronectin Adhesion Plate (Part No. ECM-10113): One 96-well plate containing 72 Bovine Fibronectin coated wells , 8 BSA-coated wells and 8 poly-lysine coated wells(see layout below)
2. Fluorecent dye Solution(Part #: 10003): 50 ul in an amber vial
3. PBS
Materials Not Supplied
1. Cell culture medium
2. Serum free medium, such as DMEM containing 0.5% BSA, 2 mM CaCl2 and 2 mM MgCl2
4. 1XD PBS
5. 96-well microtiter plate
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①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；
②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；
③蛋白本身性质稳定；
④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；
⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。
pEGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。pEGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。
pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因，如上图质粒图谱所示。
pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：
①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；
②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；
③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；
④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。向左转|向右转
常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端(多为黏性末端，也有平末端)，采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。
表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp)，其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
1. 宿主范围广, 对人致病性低
腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。另外，腺病毒的复制基因和致病基因均已相当清楚，在人群中早已流行（70-80%成人体内都有腺病毒的中和抗体存在）。人类感染野生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状，且病毒唑治疗有效。
2.
在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因
逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3.
能有效进行增殖，滴度高
腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。
4.
与人类基因同源
腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
5.
不整合到染色体中，无插入致突变性
逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
6.
能在悬浮培养液中扩增
293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1～20L的生物反应器中表达重组蛋白。
7. 能同时表达多个基因
这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗、和基因治疗等各个领域。
首先，给大家先分享一下有关细胞的基本知识。
细胞培养过程中绝对避免如细菌，支原体，真菌的污染，这些污染将显著地影响并改变实验结果。细胞培养因组织来源的不同而异，动物细胞一般采用黏附培养或者悬浮培养。根据其增殖潜力不同而被分为三类：原代细胞，细胞株，细胞系。
贴壁细胞：黏附细胞需要附着后才能生长，不断增殖的细胞在细胞培养器皿上铺成单细胞层。许多细胞在铺满细胞培养器壁后就不再增殖，有些细胞在此之后会死亡。从组织中得到的大多数细胞都是贴壁细胞。
悬浮细胞：悬浮细胞在培养基中存活和增殖，不需要黏附在细胞培养器皿上，包括造血干细胞（来源于血液，骨髓，脾脏），一些转化的细胞系以及恶性肿瘤细胞等。
原代细胞：由酶法、化学法或者机械法得到的组织碎片中的细胞迁移到细胞培养皿上形成了原代细胞，这些细胞在分散组织的过程中幸存下来，黏附或者悬浮于细胞培养液中，之后进行增殖。这些细胞不能或者仅能进行有限的细胞分裂，分裂相结束后进行衰老相，最后死亡。黏附原代培养细胞对接触抑制特别敏感，一旦铺满细胞培养皿他们就停止生长。培养原代细胞通常比培养细胞系更加困难。在实验中有时需要用到原代细胞而不是细胞系。
细胞株：从原代细胞开始的头几次传代所得到的细胞被称为细胞株。这些细胞传代几次后就衰老了，但可以导入病毒的转化因子增加细胞株的增殖代数。这些细胞的表型介于细胞株和细胞系之间，他们可以更长时间的增殖，但最终他们和细胞株一样也会衰老，停止分裂。在筛选稳定转化的细胞克隆时，使用这些细胞比原代细胞更方便。
细胞系：细胞株最终都会死亡，但他们中的某些个体发生了一些可稳定遗传的突变，这些突变使得这些细胞能够无限的增殖。这类细胞和它的后代被称为细胞系，这个过程被称为体外转化或永生化，这和体内的细胞癌变相似。无论是自发还是经过某种诱变剂的诱导，龋齿类动物的原代细胞会更容易形成细胞系。相比较而言，人的原代细胞很少会形成细胞系，但是从人癌组织中分离得到的细胞通常是永生的，可以传代成细胞系。细胞系比原代细胞和细胞株更易于使用。
下面简单先提几个问题：
问题：细胞污染问题解决（操作注意事项和污染源分析）
小编回复：
安全操作须知：操作所有可能具有感染性的材料应当遵循以下原则：操作细胞时严格按照细胞操作规程以最大可能避免操作者和细胞中可能带有的致病因子接触，操作细胞应当在合格的层流超净台中进行，注意无菌并且避免气溶胶的生成。操作完成后，所产生的废弃物应当用湿热灭菌或浸没在合适的去感染物溶液中。
无菌操作和尽量避免气溶胶产生所用的器械和溶液应该事先经过彻底灭菌，工作之前用消毒液擦拭台面，试剂瓶和手。操作过程避免形成气溶胶，吸入气溶胶是有害的。气溶胶也有可能会导致细胞之间的交叉污染。因此，应选用TD（todeliver）吸管而不是TC（tocontain）吸管，所用的吸管后端应该塞上棉花。混合溶液时避免快速的吸上吸下，吹出的液体时不要用力过猛。移液时移液管口尽量与培养瓶中液面接近。使用离心机时确保离心管盖是合上的，避免液滴残留在离心管盖附近。使用带盖的离心转头时，运行前务必盖紧。
使用层流超净台：保证层流超净台放置地方的气流不被经常搅动。避免把它安置在门口，通气口或经常有人活动的地方。超净台应放在专门的细胞培养间内。保持超净台的整洁，不把东西堆放在里面。工作之前，给工作台面和试剂瓶外表面消毒，把所有细胞操作作用到的东西都放在超净台内。有序排列器械，吸管，试剂瓶和垃圾杯，把用过的物品和干净的物品分开摆放。移动废物品时避免从干净的物品上经过。
细胞污染：细胞污染物会抑制细胞的生长，导致细胞死亡，使实验结果不一致。无论是细胞培养新手还是老手都会出现这样的问题。可以导致污染的途径举不胜举，例如不规范的操作，被污染的培养基，试剂，器械（如枪头），或是携带在操作者身上和来自其他实验室中的微生物。在动物细胞培养中，细菌，真菌，霉菌，支原体和其他种类细胞是常见的污染物。规范的操作可以帮助避免细胞被微生物和其他种类的细胞污染。为了减少偶尔细胞污染所造成的损失，我们建议冻存细胞保种，即使细胞被污染了也能够及时补充新的细胞。
微生物污染：细胞微生物污染后，有些情况下细胞培养基会变浑浊，pH值发生显著变化（通常为细菌污染）。另一些情况下，微生物污染不会使细胞培养液变浑浊，对细胞也不会产生明显的影响。例如支原体污染是一种极为常见，但极难检测到的微生物污染。
支原体污染-检测：支原体是一些体型小，生长缓慢的原核生物，它们没有细胞壁，是常见的细胞污染微生物。常用的抗生素和抗真菌药一般对支原体都没有作用。更糟糕的是，由于支原体一般不会比细胞生长更快也就不会引起细胞培养基的浑浊度和颜色变化，所以它们会长时间存在而不被发现，并会迅速传播到其他细胞中去。支原体污染会抑制细胞的代谢和生长，也会干扰细胞的核酸代谢和细胞的抗原性。急性的支原体感染会使所有的细胞状态变坏，有时候有个别细胞会形成克隆。有三种主要的检测支原体的方法：Hoeschest33258染色；支原体特异的DNA探针（FisherScientifie）；基于PCR的方法（如MinervaBiolabs的VenorGeMMycoplasmaDetectionKit）。另外，ATCC和MicroBIOLOGicalAssociates都提供付费的基于PCR的支原体检测服务。
支原体污染-清除：处理支原体慢性污染的细胞最明智的方法是丢弃它，用湿热灭菌或焚烧彻底消灭污染物。处理的方法主要是用各种商业化的抗生素处理，如Mynox®MycoplasmaEliminationReagent（MinervaBiolabs），enrofloxacin（Baytril®），及tiamulin和minocycline的混合处理（BM-Cyclin）。
细胞的交叉污染：细胞被另一种快速生长的细胞污染是较为严重的问题。为避免交叉污染，需要向可以保证质量的细胞库订购细胞，在超净台中一次只处理一种细胞，给不同的细胞分别准备所需的枪头，试剂，培养基。并且定期检查细胞的形态和生长特征。
我现在手上有PMD2.G与PSPAX2两个载体，求推荐与其配套的慢病毒过表达载体，谢谢。
启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合,从而起始基因转录的一段DNA序列,通常位于基因上游.一个典型的启 动子包括CAAT-box和TATA-box,它们分别依赖DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点,一般位于转录起始位点上游几十个碱基处.在核心启动子上 游通常会有一些特殊的DNA序列,即顺式作用元件,转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录.一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可 启动基因转录,因此启动子是基因表达调控的重要元件,它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质.
根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子.
标记基因通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。
如：某种具有氨苄抗性基因质粒（该基因即可认为标记基因），与外源DNA片段组合形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有氨苄抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。当用选择培养基（比如含有氨苄的培养基），来培养受体细胞时，能够在培养基中存活下来的受体细胞就可以认为是成功的导入了外源DNA，标记基因就起作用了。
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。
如：
绿色荧光蛋白(gfp)基因。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生光，GFP
Cdnad开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。
在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子，双子叶植 物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子，它具多种顺式作用元件。其转录起始位点上游-343～-46bp是转录增强区 ，-343～-208和-208～-90bp是转录激活区，-90～-46bp是进一步增强转录活性的区域，在了解CaMV 35S启动子各种顺式作用元件的基础上，人 们利用它的核心序列构建人工启动子，以得到转录活性更高的启动子，Mitsuhara等利用CaMv 35s核心启动子与CaMV 35S启动子的5‘端不同区段 和烟草花叶病毒的5’非转录区（omega序列）相连，发现把两个CaMV 35S启动子-419～-90（E12）序列与omega序列串联，在转基因烟草中GUS有 最大的表达活性，把7个CaMV35S启动子的-290～-90（E7）序列与omega序列串联，非常适合驱动外源基因在水稻中的表达。用这两种结构驱动 GUS基因表达，在转基因烟草和水稻中GUS活性比单用CaMV 35S启动子高20～70倍。
另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒（cassava vein mosaic virus ）中分离的。该启动子 -222～-173bp负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中表达，其中-219/-203是TGACG重复基序，即as1 （activating sequence 1），-183/-180为 GATA（又称为as2），这两个元件的互作对控制基因在绿色组织中表达至关重要。该启动子-178～-63bp包含负责调控基因在维管组织中表达的 元件。CsVMV启动子在转基因葡萄中驱动外源基因的转录能力与使用两个串联的CaMV35S启动子相当，两个串联的CsVMV启动子转录活性更强。 Rance等利用CoYMV（commelina yellow mosaic virus），CsVMV启动子区和CaMV 35S启动子的激活序列（as1，as2）人工构建高效融合启动子，瞬 时表达实验表明该启动子可驱动报告基因在双子叶植物烟草中高效表达，在单子叶植物玉米中其驱动能力比通常使用的γ玉米蛋白启动子高6倍。因此用这种人工构建的高效 启动子驱动抗病基因或目的蛋白基因，在双子叶和单子叶植物中均可达到较理想的效果。
人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子，并初见成效，例如肌动蛋白（actin）和泛素（ubiquitin）等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β 亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果。
由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在 整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻 碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。因此， 人们寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。
②组织特异启动子（tissue-specific promoter）又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。例如烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29，豌豆的豆清蛋白（leguimin）基因启动子可在转化植物种子中特异性表达，马铃薯块茎储藏蛋白（patatin）基因启动子在块茎中优势表达。
2.1根特异启动子
根的发生和发育是植物发育过程中的重要问题，研究根中特异表达基因及其启动子无疑是重要的。拟南芥根中特异表达的黑芥子酶（myrosinase）是由Pyk10基因编码的。Pyk10启动子中存在若干器官特异性表达和 植物激素应答的特异元件，如ACGT-核心序列、CANNTG-motifs、GATA-motifs、诱导物（elicitor）应答元件W-box（（T）TGAC（C））、植物激素应答 元件（如as-1元件、生长素和脱落酸应答元件、Myb元件）和细胞特异表达元件等。其中ACGT，CANNTG，GATA等顺式作用元件是决定组织器官特异 表达的转录因子结合位点，Myb元件在控制植物次生代谢、调节细胞形态建成及信号传导通路中起作用。
根特异表达系统可用于研究转基因植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等问题。BoriSjuk等用根特异启动 子mas2‘，GFP和烟草钙网蛋白（calreticulin）基因构建融合表达载体，水培转基因烟草结果表明，根细胞不仅能够高效生产GFP，而且可将目的 蛋白质分泌到液体培养基中。因此利用该启动子与其他有用的能编码蛋白质的基因融合，不仅可大量生产目的蛋白质，且更便于回收产物。
2.2 茎特异启动子
Trindade等利用cDNA-AFLP技术从马铃薯中分离了一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511（transcript derived fragment），其基因Stgan可能参与植物体内影响赤霉素水平的复合物的合成。在NCBI数据库中，比较Stgan启动子与马铃薯的patatin Ⅰ和Ⅱ、 蛋白酶抑制子、nodulin 22K和23K等编码蛋白质基因的启动子，发现它们包含一些可能与蔗糖应答反应有关的共有序列；该启动子还包含植物 中几个保守的转录因子（如Dof1，Dof2，Dof3和PBF）的结合位点。构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化烟草，GUS组织化学染色显示该启动子 驱动基因在茎结节处特异表达，可能参与块茎形成过程。
研究在茎中特异表达基因的启动子，不仅可从分子水平了解茎的发生、分化过程，更重要的是利用这些启动子调 节植物代谢可满足人类需求，如人们对木质素生物合成及其调控的研究。木质素是植物体内仅次于纤维素的一种含量丰富而重要的有机大分子 物质，它的存在对于增加植物机械强度、远距离水分运输和抵抗外界不良环境的侵袭都是非常有益的。然而，木质素的存在也有一定的负面作 用。因此，人们希望通过调节木质素的合成以降低其含量。目前多使用CaMV35S启动子驱动目的基因，近年来已分离一些木质素生物合成途径中 关键酶基因的启动子，如4CL，F5H等基因的启动子，人们正在尝试利用这些特异性启动子来调节木质素的生物合成。Bell-Lelong等已从拟南芥 中分离了肉桂酸羟-4-基化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）基因的启动子，本实验室首次从毛白杨中分离了C4H启动子，并对该启动子的功 能进行了初步鉴定。GUS组织化学染色和GUS荧光测定结果表明。G4H启动子驱动外源基因在烟草茎的维管组织中丰富表达，有望将来利用该启动 子驱动功能基因调控木质素的生物合成过程。
2.3 叶特异启动子
Marraccini等从咖啡（coffea arabica）中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（rubisco）小亚基基因RBCS1， 该基因在一年生植物咖啡的叶中特异表达。研究发现RBCS1启动子上游GTGGTTAAT序列与豌豆RBCS3A启动子的BoxⅡ核心序列相同；在其启动子G -box（GCCACGTGGC）两侧分别有一个类I-box（核心序列为GATAAG），形成I-G-I结构，推测G-box十个碱基的回文结构可能结合某个转录因子；其AT-1 box（AGAATTTTTATT） 与其他RBCS和CAB基因的AT-1 box（AATATTTTTATT）相比只有两个碱基不同；类L-box（AAAATTAACCAA）与马铃薯RBCS1和RBCS3A启动子的相同。由此 可见，植物叶特异表达顺式元件具高度保守性。
有趣的是Taniguchi等在玉米中发现了一个双元启动子系统（dual promoter system）。PPDK（pyruvate， orthophosphate dikinase）是C4植物光合反应中的一个叶绿体酶，该酶基因Pdk具有一个双元启动子系统（C4Pdk启动子和细胞质Pdk启动子）。这 两个启动子的区别在于起始密码子和拼接方式的差异，C4Pdk启动子驱动Pdk转录成较长的mRNA。基因产物定位在叶绿体中；细胞质Pdk启动子在 Pdk基因的第一个内含子中，驱动Pdk转录成较短的mRNA，它所编码的蛋白质定位于细胞质中，又称为细胞质Pdk启动子。C4Pdk启动子是受光诱 导的强启动子，驱动基因在玉米叶肉细胞中特异表达；而细胞质Pdk启动子是个弱启动子，且不具有组织特异性。大多数C4植物的光合作用相关 基因的表达具有细胞特异性，且主要在转录水平调节基因表达活性，因此，可利用该启动子在C4植物叶肉细胞中高效表达外源基因。
