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生物发光，是生物素酶

首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同

一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。
RNA干扰主体实验的重点在于： 按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：
⒈转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；
⒉nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；
⒊positive siRNA对照（监控假阴性）；
⒋技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；
⒌rescue 对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown的特异性）；6.全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。
实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，1,2两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照，基本是所有杂志都要求具备的。4,5两种对照，主要是为了解决off-target效应，选做一种即可，一般建议选5，涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”， 一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。
mRNA水平：RT-PCR、Real-time PCR；蛋白质水平：Western-blot、ELISA、免疫组化；细胞表型水平：MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。RNA干扰效率在动物模型上的进一步验证（体内）　动物模型实验可以采取“体内法”和“体外法”。
体内法，即先做裸鼠成瘤模型，再将质粒或病毒导入裸鼠，检测RNA干扰效果。此法操作复杂，对质粒和病毒产品的质和量要求都较高，但是比较贴近实际，说服力较显著。体外法，即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞，再将肿瘤细胞导入动物体内，然后检测RNA干扰效果。此法操作较简单，对质粒和病毒产品的质量要求较低，所以为大多数文献所采用。建议采用此方法来进行动物模型水平的实验。向左转|向右转

现要针对细胞中的某种抑制蛋白IF1(基因大概300多bp)构建干扰以及过表达的慢病毒载体，如果找公司构建3个干扰的慢病毒，收到之后需要筛选出干扰效率最高的，请问该如何筛选？如何判断其干扰效率？过表达的又该怎么办？做完转染之后，我需要用TNF-α处理细胞，然后检测细胞的增殖、凋亡以及抑制蛋白IF1的表达情况，这样的话我是不是需要构建稳定株？(新手，且无人指导，所以有很多问题)还望有前辈可以多多指点迷津

由于实验需要，想要求助带Hygro（+）筛选标记的真核表达载体，我们实验室有原核pET22b,pET28a,真核pCDNA3.1,pCDNA6，PEE12.4，,pICZa-A（酵母），还有HEK293，293F悬浮，CHO-K1，CHO-S等各种真核表达体系细胞以及各种肿瘤细胞，希望站友鼎力相助，跪谢

病毒载体有哪些？有什么优缺点？

病毒量偏高了，要治疗

pCAMBIA系列载体是常用的植物表达双源载体，载体的骨架是pUC18。其中 pCAMBIA1300， pCAMBIA2300均无gus报告基因，pCAMBIA系列载体均含有卡那霉素抗性基因。

pCAMBIA2300特点：
大肠杆菌筛选抗性：卡那霉素。
植物筛选抗性：卡那霉素。

各位好，最近构建慢病毒沉默载体，问题是提完质粒酶切验证是阳性，但是测序检测不到插进去的shRNA，已经重复连接转化多次，依旧没有得到阳性质粒，请大神帮忙分析下原因，感谢！！

siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。RNA干扰主体实验的重点在于： 按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：⒈转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）

希望可以官方一点，科学一点，如果有ppt是最好，深入浅出，如果有具体例子最好

NA的种类：
　　在生物体内发现主要有三种不同的RNA分子在基因的表达过程中起重要的作用。它们是信使RNA（messengerRNA，mRNA）、转运RNA（tranfer RNA，tRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）。RNA含有四种基本碱基，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外还有几十种稀有碱基。
　　RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3'，5'磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那样都是双螺旋结构，只有在许多区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要4～6对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。【RNA的二级结构】细胞内有三类主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。它们各有特点。在大多数细胞中RNA的含量比DNA多5～8倍。【大肠杆菌RNA的性质】
　　mRNA
　　生物的遗传信息主要贮存于DNA的碱基序列中，但DNA并不直接决定蛋白质的合成。而在真核细胞中，DNA主要贮存于细胞核中的染色体上，而蛋白质的合成场所存在于细胞质中的核糖体上，因此需要有一种中介物质，才能把DNA 上控制蛋白质合成的遗传信息传递给核糖体。现已证明，这种中介物质是一种特殊的RNA。这种RNA起着传递遗传信息的作用，因而称为信使RNA(messenger RNA，mRNA)。
　　mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，完成基因表达过程中的遗传信息传递过程。在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。因为这种未经加工的前体mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差别很大，所以通常称为不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA）。
　　tRNA
　　如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。但是，合成蛋白质的原材料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，必须用一种特殊的RNA——转运RNA（transfer RNA，tRNA）把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。每种氨基酸可与1-4种tRNA相结合，现在已知的tRNA的种类在40 种以上。
　　tRNA是分子最小的RNA，其分子量平均约为27000（25000-30000），由70到90个核苷酸组成。而且具有稀有碱基的特点，稀有碱基除假尿嘧啶核苷与次黄嘌呤核苷外，主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。这类稀有碱基一般是在转录后，经过特殊的修饰而成的。
　　1969年以来，研究了来自各种不同生物，:如酵母、大肠杆菌、小麦、鼠等十几种tRNA的结构，证明它们的碱基序列都能折叠成三叶草形二级结构（图3-23），而且都具有如下的共性：
　　① 5’末端具有G（大部分）或C。
　　② 3’末端都以ACC的顺序终结。
　　③ 有一个富有鸟嘌呤的环。
　　④ 有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。
　　⑤ 有一个胸腺嘧啶环。
　　rRNA
　　核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。
　　rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。S为沉降系数（sedimentation coefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。
　　rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。在双链区，碱基因氢键相连，表现为发夹式螺旋。
　　rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全明了。但16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这可能有助于mRNA与核糖体的结合。
　　
　　snRNA
　　除了上述三种主要的RNA外，细胞内还有小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端体酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。
　　有的RNA分子还具有生物催化作用。
　　上述各种RNA分子均为转录的产物，mRNA最后翻译为蛋白质，而rRNA、tRNA及snRNA等并不携带翻译为蛋白质的信息，其终产物就是RNA。
　　2006诺贝尔医学奖成果RNA干扰机制解读
　　1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！科学界对此感到极度困惑。
　　类似的谜团，直到美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛发现RNA（核糖核酸）干扰机制才得到科学的解释。两位科学家也正是因为1998年做出的这一发现而荣获今年的诺贝尔生理学或医学奖。
　　根据法尔和梅洛的发现，科学家在矮牵牛花实验中所观察到的奇怪现象，其实是因为生物体内某种特定基因“沉默”了。导致基因“沉默”的机制就是RNA干扰机制。
　　此前，RNA分子只是被当作从DNA（脱氧核糖核酸）到蛋白质的“中间人”、将遗传信息从“蓝图”传到“工人”手中的“信使”。但法尔和梅洛的研究让人们认识到，RNA作用不可小视，它可以使特定基因开启、关闭、更活跃或更不活跃，从而影响生物的体型和发育等。
　　诺贝尔奖评审委员会在评价法尔和梅洛的研究成果时说：“他们的发现能解释许多令人困惑、相互矛盾的实验观察结果，并揭示了控制遗传信息流动的自然机制。这开启了一个新的研究领域。”
　　科学家认为，RNA干扰技术不仅是研究基因功能的一种强大工具，不久的未来，这种技术也许能用来直接从源头上让致病基因“沉默”，以治疗癌症甚至艾滋病，在农业上也将大有可为。从这个角度来说，“沉默”真的是金。美国哈佛医学院研究人员已用动物实验表明，利用RNA干扰技术可治愈实验鼠的肝炎。
　　目前，尽管尚有一些难题阻碍着RNA干扰技术的发展，但科学界普遍对这一新兴的生物工程技术寄予厚望。这也是诺贝尔奖评审委员会为什么不坚持研究成果要经过数十年实践验证的“惯例”，而破格为法尔和梅洛颁奖的原因之一。
　　诺贝尔生理学或医学奖评审委员会主席戈兰·汉松说：“我们为一种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的科学家证明是正确的，是给它发个诺贝尔奖的时候了。”
　　补充
　　核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。
　　RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基。
　　与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。
　　在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA）, rRNA（核糖体RNA）, mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
　　在病毒方面，很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体（有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体）。
　　1982年以来，研究表明，不少RNA，如I、II型内含子，RNase P，HDV，核糖体大亚基RNA等等有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶（ribozyme）。
　　20世纪90年代以来，又发现了RNAi（RNA interference，RNA干扰）等等现象，证明RNA在基因表达调控中起到重要作用。
　　在RNA病毒中，RNA是遗传物质，植物病毒总是含RNA。近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子，叫做类病毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子，此外，真核细胞中还有两类RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前体；snRNA参与hnRNA的剪接（一种加工过程）。自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基序列确定以后，RNA序列测定方法不断得到改进。目前除多种tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等较小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测定已完成，如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。